细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术

New Application: industrial process improvement
高通量解析工业生物过程
回答工业过程的三 个基本问题
基因组+转录组回 答为什么? WHY
蛋白质组回答如 何进行? HOW
代谢组回答是什么? WHAT
Proteomics Metabolomics
Lipidomics
概述
紫杉醇作用机理:
(1979年)
与β微管蛋白 N 端第 31位、217~ 231位氨 基酸结合，抑制微 管解聚，抑制有丝 分裂，阻滞细胞周 期于G2/M期,使癌细 胞死亡。
概述
1992年FDA批准紫杉醇 2006年FDA批准多烯紫杉醇
晚期乳腺癌, 晚期非小细胞肺癌 晚期卵巢癌, 胰腺癌、头颈癌 胃癌,前列腺癌
概述
细胞生长与紫杉醇合成
❖关系:非偶联 ❖高产措施: ❖诱导子:稀土铈离子/真菌多糖/
甲基茉莉酸
❖培养策略:前体饲喂/两相培养等
红豆杉细胞培养生产紫杉醇是很有潜 力的技术,需要解析微观生物过程.
关键问题
百度文库
现象
实验
形态变化:细胞分化与紫杉醇生产 细胞应答机理: 活性氧迸发刺激 紫杉醇合成,同时引起细胞凋亡
固定化细胞的信号转导与调控
Susp.
Immob.
ERK-like 磷酸化 Cheng JS, Yin DM, Yuan YJ*. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(6): 1250-1257
固定化细胞对MAP like-Kinases 磷酸化响应及调控作用
微环境 剪切力场
系统生物技术
➢手段:测序技术革命,NMR,GC-MS,LC-MS,2DE-MS,
➢基因组
➢转录组
➢蛋白质组
➢代谢组
DNA Databases
Compare, cluster, integrate
数据有待积累 理论有待建立 最终必将突破
New Theory: structure and function
概述
紫杉醇与多烯紫杉醇
(CH3)3CO
C6H5CONH O
C6H5 3' 2'
O
OH
CH3COO H
10 13
1 2
HO
O OH
7
C6H5COO
O
CH3COO
紫杉醇原料来源
1)天然红豆杉植物提取法
概述
2) 化学全合成
RO O
HO A
(1) Holton路线----线性途径
A→AB→ABC。
HO
微环境:固定化
ø: 15mm h: 15mm
固定化提高了紫杉醇的产量
固定化不同区域的细胞活性与产量的关系 细胞活力： 由外层到核心降低
紫杉醇合成活力： 由外层到核心增加
固定化细胞出现分化：AGPs 表达
Susp. Immob.
Cheng JS, Lei C, Wu JC, Yuan YJ*. Journal of Biotechnology, 2008, 133(1): 96-102.
❖02年 天津市“131”人才工程第一层次；
❖03年 天津市特聘教授；
❖04年 国家杰出青年基金获得者;天津市授衔专家
❖07年 国家教学名师
报告内容
❖ 紫杉醇的药源问题 ❖ 蛋白质组研究 ❖ 代谢组研究 ❖ 合成生物学研究
概述
紫杉醇的发现
1958,美国NCI开始筛选新型抗肿瘤药物研究计划; 美国化学家Wani和Wall于1971年从太平洋红豆 杉树皮中提取到一种抗肿瘤物质紫杉醇。
❖侧链：化学合成；
C6H5CONH O
C6H5
3
2
1
HO
OH
13
RO
10
1
O OH
7
OH
(2R,3S)-3-N-苯甲酰基苯基异丝氨酸
HO
C6H5COO
O
CH3COO
避免了合成紫杉醇复杂的母环部分
4)生物工程方法
※ 红豆杉细胞培养
※ 2004 年 6 月 28 日 ， Bristol-Myers Squibb 获总统绿色化学挑战奖。
J-S Cheng, Y-J Yuan. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009, 58:84–92
Metabolite profiling of Taxus cells in response to shear stress by GC-TOF-MS
细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术
元英进 天津大学 2009-08-12,昆明
元英进
❖84年 天津大学,学士；87硕士；91博士；
❖93年副教授，95年教授，96年任博导；
❖97年 教育部跨世纪优秀人才
生物制药与现代中 药工程
❖99年人事部“百千万人才工程”第一、二层次；
❖00年-至今 历任化工学院副院长、院长;
Oxidative response of cells induced by shear stress
Histochemical detection of H2O2 in cells by DAB staining
Cell death was evaluated by Evans Blue staining
Cheng JS, Yuan YJ*. Biotechnology and Applied Biochemistry, 2006, 44: 109-117
蛋白组分析方法揭示固定化细胞时空异质性
2-DE和MS，细胞生 长、生产与固定化微 环境作用的关系蛋白 质组。 发现氮、硫和糖代谢 相关的蛋白质与细胞 分裂和次代谢产物之 间的关系 为细胞培养方式选择 Cheng JS, Yuan YJ. Proteomics 2006, 6, 2199-2提00供7 依据
Changes of four identified proteins in media based on 2-D
Functional categories of identified proteins by 2-D LCMS/MS
Functional categories of identified proteins by 2-D LC-MS/MS
OH
B
C
(2) Nicoloau路线----会聚式
C6H5COO
DO
CH3C OO
A环和C环→ 八元B环，得到ABC三环化合物。
(3) Danishefsky路线----会聚式
D环→与A和C、D环片段连接，合成八元B环。
3) 半合成紫杉醇
• 母核：红豆杉针叶中提取巴卡亭 III（R=Ac）或 10-去乙酰基巴卡亭 III（10-DAB，R=H）