5blood实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析

实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析
5.1 相关基础知识
人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期（G0期），一般情况下是不再分裂的。

在培养液中加入植物凝血素（PAH）时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。

这样经过短期培养、秋水仙素的处理、低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。

目前本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等领域广泛采用。

人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。

根据各组染色体的特征予以分组：A组：（N01～03）是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部；B组（N04～05）为两对大的亚中着丝粒染色体，它们有显的长臂和短臂；C组（N06～12+X）为中等大小的亚中着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；D组（N013～15）为中等大小的端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；E组（N016～18）包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体；F组（N019～20）为两对小的中着丝粒；G组（N021～22+Y）为最小的一组端着丝粒染色体，在N021～22的短臂上可见随体，Y常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。

5.2 实验目的和要求
(1)掌握人体微量血液体外培养技术和制备染色体标本的方法；
(2)观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。

5.3 实验材料和仪器
5.3.1 实验材料和试剂
(1)人的外周血淋巴细胞；
(2)Giemsa母液：量取33ml甘油，先在研钵内加入少量甘油与0.5g Giemsa粉混合，
研磨至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入，搅拌后于56o C水浴保温2小时，再加入
33ml甲醇，搅拌均匀后储存于棕色瓶中；
(3)Giemsa染色液：将Giemsa母液用0.1M pH7.4磷酸缓冲液稀释至10倍。

5.3.2 实验仪器和设备
(1)灭菌注射器（5ml）
(2)离心管
(3)无菌吸管
(4)量筒
(5)培养瓶
(6)试剂瓶
(7)其它：酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，冰盒、载玻片、切片盒、光学
显微镜等
5.4 实验方法和步骤
5.4.1 淋巴细胞培养与处理
(1)培养液的分装：在无菌室内或接种罩内，用移液管将培养液和其他各试剂分装入
10毫升培养瓶中，1640培养液4ml，小牛血清1ml，PHA0.2ml，肝素0.05ml，
双抗(青霉素和链霉素，终浓度为100U/ml)，用3.5%碳酸氢钠调节pH为7.2~7.4。

(2)取血：用5ml灭菌注射器吸取肝素（500 U/ml）0.05毫升湿润管壁。

用碘酒和酒
精消毒皮肤，自肘静脉采血约0.3ml，在酒精灯火焰旁，自橡皮塞向培养瓶内（内
含有生长培养基5ml）接种，每瓶0.5ml左右，轻轻摇动几次。

(3)细胞培养：直立置37ºC±0.5ºC恒温箱内培养，培养66~72h。

(4)秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度为40μg/ml的秋水仙素0.05~0.1ml,
最终浓度为0.4~0.8μg/ml，置37ºC±0.5ºC恒温箱中处理2~4h。

(5)低渗处理：低渗液的种类较多，如0.075mol/L的KCl溶液，0.95%的枸橼酸钠溶
液，用蒸馏水稀释4倍的Hanks液,也可直接用蒸馏水。

本实验选用KCl溶液，秋
水仙素处理完毕，小心的从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液，培养物沉积在瓶
底，然后加入温育的低渗液5毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，分装入两个离心
管中，置37ºC±0.5ºC恒温箱内处理20min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。

(6)离心：离心机转速为1000rpm，离心5min，弃上清液，收集白细胞。

(7)固定：固定液为甲醇：冰醋酸=3：1(V/V)。

在离心管中加入固定液2ml，立即用滴
管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15min后，离心，倒去上清液，留下白细
胞。

(8)再固定：加入固定液1毫升，用吸管轻轻打散，室温下继续固定15min。

(9)再离心：倒去上清液，留下白细胞制片。

5.4.2 染色体核型分析
(1)制片：向处理好的离心管中滴入固定液0.2毫升，用滴管小心冲打成悬液，从冰箱
的冷冻室内取出冰盒，将载玻片平铺于冰盒表面，每片滴加悬液1~2滴，将载玻片置于玻璃架表面，自然风干或在酒精灯火焰上烤干。

(2)染色：用磷酸缓冲液（pH7.4）稀释后的姬姆萨染色液扣染，或在染缸中染色20分
钟，然后用镊子夹出玻片，用蒸馏水轻轻冲洗背面，颜料冲掉后，在火焰上烤干。

(3)镜检：待玻片干后，在显微镜下检查。

先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后用高倍
油镜观察
5.5 注意事项
(1)接种的血样愈新鲜愈好，最好是在采血后24小时内进行培养，如果不能立刻培养，
应置于4℃存放，避免保存时间过久，会影响细胞的活力。

(2)在培养中成败的关键，除了至为重要的PHA的效价外，培养的温度和培养液的酸
碱度也十分重要。

人的外周血淋巴细胞培养最适温度为37±0.5℃。

培养液的最适
pH7.2～7.4。

(3)培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃
恒温箱内培养。

(4)制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开，。