胡萝卜悬浮培养

实验名称：胡萝卜细胞悬浮培养和体细胞胚胎发生实验时间：2010-5

一、实验预习

1、实验目的：

1.1、过本次实验，使同学熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。

1.2、设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。

1.3、胚状体的诱导发生。

2、实验设备及材料：

2.1、主要实验用具和仪器

冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯。PH试纸、药勺、称量纸、灭菌锅、摇床等。

2.2药瓶和试剂

硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2、4-D、NAA（a-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、弄盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水、水解酪蛋白、氯化汞等。

2.3、实验材料：胡萝卜愈伤组织

3、实验原理及实验流程或装置示意图：

3.1、实验原理

胚状体方式：指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。胚状体形成在植物有性生殖中，精子和卵结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。

在生长素比细胞分裂素比值高的时候使细胞进行增殖。

水解酪蛋白属于铵态氮，对胚状体诱导起重要作用。

3.2、实验流程

3.3、装置示意图

4、实验方法步骤及注意事项：

4.1、培养基的配制

（1）、继代培养基

MS基本培养基＋0.1mg/L 6-BA＋2mg/L NAA + 200mg/L水解酪蛋白+ 3％蔗糖（2）、诱导培养基

MS基本培养基＋200mg/L水解酪蛋白＋3％蔗糖

4.2、在无菌条件下，用镊子夹取胡萝卜根的愈伤组织，置于一个无菌培养苗当中，将愈伤组织切成适当大小，同样也可以将愈伤组织捏碎，用解剖刀挑取愈伤组织接种于细胞悬浮培养基中。

4.3、在三角瓶中接种大约500mg的愈伤组织。

4.4、接种后将三角瓶置于摇床上，转速一定，在25-27摄氏度下培养。

4.5、继代培养，在接种两个星期之后继代。继代方法是：先用孔径为100um 的无菌尼龙滤网将培养物滤去。除去滤网上的愈伤组织碎块和大的细胞团。

4.6、通过镜检查看实验结果。

4.7、将镜检合格的细胞过滤培养液转移到胚状体诱导培养基当中，培养瓶封口后置于黑暗条件下培养。

4.8、在体视显微镜下进行镜检，观看愈伤组织的诱导情况。

二、实验内容

1 、实验现象、数据及观察结果

细胞继代悬浮培养当中，由于无菌操作不当，致使培养基有细菌浸染，颜色呈深黄色，培养基较浓，同样有细胞的增值可以看到大块大块的愈伤组织悬浮或沉淀在培养基但中。虽然自己的没有结果，但是在看了别人的体视显微镜结果后可以看到，过滤后的细胞悬浮培养液中有单细胞以及多个细胞组成的细胞团块，细胞呈球状或者是有一定的立方体型，细胞较透明，其余的有一些细胞的碎屑分布在悬浮培养液但中。

右图为胚状体示意图，组织培养条件

下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化

后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过

原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚

期和子叶期，进而成为成熟的有机体。在

这次培养过程当中，可以明显的看到胚状

体的发生，实验时成功的。同样在观察的

过程当中，可以看到有一定的细胞碎屑，

主要是在摇床培养当中产生的。

三、实验小结

本次实验成败之处及其原因分析、改进措施：

本次实验基本成功，但其中也有不足之处，所以需要再接再厉，做的更好。

不足之处：

（1）、由于实验无菌操作出了问题，使愈伤组织的继代培养受到污染。

（2）、实验镜检看到的单细胞太少，细胞团块有些多。

（3）、悬浮培养基但中的细胞碎片多。

鉴于以上种种现象，实验当中应该注意的事项之外还有一些改进措施：

（1）、注意无菌操作技术的熟练。

（2）、本次实验只进行了一次的继代培养，所以对细胞的团块现象消除效果不是很理想，如果条件允许的话，可以进行多几次的继代培养，使细胞团块减少，单细胞数量增加。

（3）、细胞悬浮培养细胞碎片太多的原因可能是摇床的速度偏大导致，所以适当降低转速估计可以降低细胞的碎片。

组织培养当中的无菌操作时必须条件，养成良好的习惯对实验的成败十分有帮助。在悬浮培养当中要注意实验阶段各个环节的参数的设定，使细胞悬浮培养达到最优的效果。

指导老师评语及得分：

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