抗除草剂转基因玉米育种筛选方法的建立

１．５ ＰＣＲ 检测
１ 材料与方法
１．１ 材料
以 Ｂａｒ 基因序列设计引物，ＰＣＲ 引物为 ５＇－ＣＡＧＧ ＡＡＣＣＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡ－３＇ 和 ５＇－ＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡ ＣＧＴＣＡＴＧＣＣ－３＇。 反 应 体 系 为 ：１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ
所用玉米材料 （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）是吉林省常用的骨 干自交系铁 ７９２２、吉 ８９０２ 和丹 ３４０ 及转 Ｂａｒ 基因的 Ｔ２ 植株的种子 （Ｔ３ 代）（其受体分别为铁 ７９２２、吉 ８９０２ 和丹 ３４０），以及引进的美国自交系 ＰＡ９１ 和已
Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍａｉｚｅ ｉｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍ
Ｗｕ Ｓｈｕｘｉａｎｇ ２ Ｊｉａｎｇ Ｚｈｉｌｅｉ １ Ｋｏｎｇ Ｘｉａｎｇｍｅｉ １ Ｙｉｎ Ｋｕｉｄｅ ２ ＹｕａｎＹｉｎｇ １ Ｌｉ Ｘｉａｏｈｕｉ １ Ｌｉｕ Ｄｅｐｕ １＊
Ｍｉｘｔｕｒｅ，０．５ μＬ；１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ，２．５ μＬ；１０ μｍｏｌ／ｍＬ ｓｅｎｓｅ，１ μＬ；１０ μｍｏｌ／ｍＬ ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ，１ μＬ；模板 ＤＮＡ， １ μＬ；Ｅｘ－Ｔａｑ，０．２ μＬ （５ Ｕ）；ｄｄＨ２Ｏ，１８．８ μＬ。扩增程 序为：（１） ９４℃，预变性 ５ ｍｉｎ；（２） ９４℃，变性 １ ｍｉｎ
１ 吉林省农业科学院生物技术研究中心， 长春， １３０１２４； ２ 黑龙江八一农垦大学， 大庆， １６３３１９ ＊ 通讯作者， ｌｉｕｄｐ＠ｃｊａａｓ．ｃｏｍ
摘 要 本试验建立了一个以除草剂抗性为选择标记的玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）转基因育种中的早期世代批量快速 筛选技术。通过对玉米自交系铁 ７９２２、吉 ８９０２、丹 ３４０、ＰＡ９１ 以及转 Ｂａｒ 基因 ＰＡ９１ 玉米 ＰＡ９１ＴＢＡ５２３ 在营 养钵中浸灌 ２５０ ｍｇ／Ｌ、５００ ｍｇ／Ｌ、１ ０００ ｍｇ／Ｌ、１ ５００ ｍｇ／Ｌ 不同浓度的 Ｂａｓｔａ 除草剂的萌发试验，确立了不能正 常生长的临界浓度：铁 ７９２２ 在 ２５０ ｍｇ／Ｌ 的除草剂中无法生长，吉 ８９０２ 在 ５００ ｍｇ／Ｌ 的除草剂中无法生长；转 基因材料 ＰＡ９１ＴＢＡ５２３ 在除草剂达到 １ ５００ ｍｇ／Ｌ 仍与不浸灌除草剂的对照无明显差异。利用此方法对花粉 管通道法转化获得的转基因 Ｔ０ 植株的种子进行鉴定和筛选，从 Ｔ０ 植株种子（Ｔ１）获得阳性植株 ６ 株，３ 株获得 种子，对获得的种子（Ｔ２）再做除草剂筛选，抗性植株 ＰＣＲ 检测均表现阳性。对以往的转基因 Ｔ３ 做批量规模筛 选，可以淘汰大量（７０％）非转基因和表达不强的株系或个体，减少了田间种植工作量，提高了育种效率。 关键词 玉米转基因， 除草剂， 筛选
基金项目：本研究由国家转基因植物中试及产业化基地（吉林）专项（ＪＹ０３－１７－１）资助
分子植物育种 １５６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
２００２），同时，抗除草剂作物的开发也是作物基因工程 长、数量、苗高度等。
中最活跃的领域 （孙丙耀等， ２００２）。目前，国际上转 ＥＰＳＰＳ 抗农达除草剂玉米和转 Ｂａｒ 基因抗 ＰＰＴ 玉米， 是面积最大的转基因抗除草剂玉米，已产业化。国内 转的较多抗除草剂基因是 Ｂａｒ 基因 （梁雪莲等， ２００１； 段发平等， ２００１； 张宏军等， ２００２； ２００４； 王宜林和李 宏， ２００５， 生物学通报， ４０（４）： １５－１７； 刘小红， ２００７），取 得很大的成功，已进入田间育种阶段。本试验室采用 花粉管通道技术已将 Ｂａｒ 基因转至玉米，获得转基因 株系，并对株系进行选择。实验证明，对于不依赖组织
转 Ｂａｒ 基因株系 ＰＡ９１ＴＢＡ５２３ （其受体为 ＰＡ９１）。转 （３） ５５℃，退火 ５０ ｓ；（４） ７２℃，延伸 １ ｍｉｎ；（５）重复步 基因 Ｔ０ 植株的种子也同时作为本试验筛选对象。除 骤（２）￣（４） ３５ 次；（６） ７２℃延伸 １０ ｍｉｎ。
草剂 Ｂａｓｔａ 由日本公司订购。
培养的花粉管转基因和任何其它方法转基因获得的 后代进入田间育种阶段都离不开对转基因材料的大 规模选择，选择的方法和策略关系到转基因育种效率 和进度。因而，实现对转基因材料方便、高效的筛选和 鉴定是转基因育种须解决的问题。本试验针对花粉管 通道法转化的 Ｔ１ 苗期及继后世代的选择培育和 Ｔ３ 材料的筛选纯合，摸索了转基因材料营养钵种子萌发 与田间筛选结合的批量筛选技术，为今后转化抗除草
据 ＡＧＢＩＯＳ 统计，全国范围内经批准的基因工 程作物品系已经达到 ７４ 种，涉及各类作物 １７ 种，有 ２８ 种基因被稳定整合进作物基因组（ＡＧＢＩＯＳ， ２００１，
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｓａｆｅｔｙ．ｉｎｆｏ／ｄｂａｓｅ．ｐｈｐ）。２０ 世纪 ８０ 年代中期，转基因抗除草剂技术引入植物保护领 域后，由于其具有诸多优点而迅速发展 （苏少泉，
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｐａｐｅｒ ｗｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａ ｑｕｉｃｋｌｙ ｂａｔｃｈ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｅ－ ｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ （Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）． Ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｔｕｎｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｔｈａｔ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， Ｉｎｂｒｅｅｄ ｌｉｎｅ Ｔｉｅ７９２２ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ｗｅｌｌ ｉｎ ２５０ ｍｇ／Ｌ， Ｊｉ８９０２ ｉｎ ５００ ｍｇ／Ｌ， ＰＡ９１ＴＢＡ５２３， ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｉｎ １ ５００ ｍｇ／Ｌ， ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｉｍｍｅｒｓｉｎｇ ｓｅｅｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｂｒｅｅｄ ｌｉｎｅｓ （Ｔｉｅ７９２２， Ｊｉ８９０２， Ｄａｎ３４０， ＰＡ９１） ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂａｒ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅ （ＰＡ９１ＴＢＡ５２３） ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｉｎ ｅａｒｔｈｅｎ ｐｏｔｓ． Ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｔ０ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｓｉｘ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ （Ｔ２ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ） ｒｅｃｏｍｆｉｒｍｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ａｓｓａｙ ａｎｄ ＰＣＲ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎｓ． Ｉｔ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａｂｏｕｔ ７０％ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ ｌｏｗ ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｏ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｐｓｅｕｄｏ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ ｉｎ Ｔ３ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ， ｗｈｉｃｈ ｕｓｅｄ ｔｏ ｂｅ ａｓ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ． Ｏｂｖｉｕｓｌｙ ｗｅ ｈａｖｅ ｓｔｒｏｎｇ ｓｕｇｇｅｓ－ ｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｇｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｔｉｍｅ－ｓａｖｉｎｇ ａｎｄ ａｌｓｏ ｓｈｏｕｌｄ ｃｏｍｅ ｔｒｕｅ ｂｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌｏｔｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ． Ｋｅｙｗｏｒ ｄｓ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍａｉｚｅ， Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ， Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
１．３ Ｔ２ 代转化材料的除草剂筛选
根据受体材料对不同浓度除草剂的反应，以最佳 的筛选浓度进行不同受体转化材料的筛选，Ｔ１ 转化材 料每穗各播种 ２０ 粒，根据萌发出苗率判断穗间的抗 感程度，将抗性好的穗留作春播，春季播种后三叶期 时再次进行除草剂喷施筛选。同时对已确定为转 Ｂａｒ 基因株系 ＰＡ９１ＴＢＡ５２３ 采取生产上所用的浓度进行 筛选，筛选出的所有抗性植株都进行 ＰＣＲ 检测。
的生长为对照，出苗后待三叶期统计观察，记录根 ＰＡ９１ＴＢＡ５２３ 长势正常。从（表 １）中也可以看出，对于
１ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｇｒｉ－Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉｌｉｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ， １３０１２４； ２ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｈｅｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ａｕｇｕｓｔ Ｆｉｒｓｔ Ｌａｎｄ Ｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｑｉｎｇ， １６３３１９ ＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ， ｌｉｕｄｐ＠ｃｊａａｓ．ｃｏｍ
基因受体的筛选临界浓度确定；ｂ：转基因 Ｔ１ 植株（种 子苗）筛选移栽；ｃ：转基因 Ｔ１ 植株种子 Ｔ２ 及继后世 代种子营养钵萌发筛选；ｄ：田间幼苗喷施筛选。
材料铁 ７９２２、ＰＡ９１、丹 ３４０ 虽然均可发芽，但是三周后 幼芽停止生长，且叶尖开始逐渐变褐，吉 ８９０２ 则可萌 发至出一片叶；除草剂浓度为 ５００ ｍｇ／Ｌ，受体材料只有
１．２ 不同受体自交系对除草剂适宜浓度的确定
将要筛选的种子播种于高 ８ ｃｍ、直径 ６．５ ｃｍ 装 有 １／３ 体积土壤的底部留有渗水孔的营养钵中，每 ６０ 个营养钵放在 １ 个托盘中，灌入所需浓度的除草 剂溶液，溶液量要使营养钵中的土一次浸透，随后根 据土壤水分需求灌入清水。以种子萌发情况和苗生
２ 结果与分析
２．１ 不同受体材料对除草剂筛选来自百度文库适宜浓度确定
试验表明，四种受体材料在一般条件下的萌发速 度有所不同，出芽最快的为铁 ７９２２，依次是丹 ３４０、 ＰＡ９１、吉 ８９０２、铁 ７９２２。在含有除草剂的土壤里萌发 则更不一样。根据试验结果可知，不同的受体材料对除
长情况确定抗感结果。筛选鉴定的技术程序是：ａ：转 草剂的反应有差异：除草剂浓度为 ２００ ｍｇ／Ｌ 下，受体
每营养钵播种 ５ 粒玉米种子，每个受体每个浓度 吉 ８９０２ 发芽，但三周后长出的幼苗停止生长，叶尖开
各播种 １０ 钵，除草剂的浓度分别为 ０ ｍｇ／Ｌ、２００ ｍｇ／Ｌ、 始变褐且趋势越来越严重。除草剂浓度为 １ ０００ ｍｇ／Ｌ
５００ ｍｇ／Ｌ、１ ０００ ｍｇ／Ｌ、１ ５００ ｍｇ／Ｌ，以 ０ ｍｇ／Ｌ 浓度苗 和 １ ５００ ｍｇ／Ｌ， 各 受 体 均 没 出 苗 ， 但 转 基 因 系
分子植物育种，２００８ 年，第 ６ 卷，第 １ 期，第 １５５－１６０ 页 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， ２００８， Ｖｏｌ．６， Ｎｏ．１， １５５－１６０
新思路、新技术、新方法 Ｎｏｖｅｌ Ｔｈｉｎｋｉｎｇ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
抗除草剂转基因玉米育种筛选方法的建立
武淑香 ２ 姜志磊 １ 孔祥梅 １ 殷奎德 ２ 袁英 １ 李晓辉 １ 刘德璞 １＊
１．４ Ｔ１ 代转化材料的除草剂筛选
采取相同的筛选方法以最佳的筛选浓度将上年 用花粉管通道技术转化的 Ｔ０ 植株种子全部播种于 营养钵中，做除草剂萌发筛选。获得的抗性植株移栽 至大盆，按正常方法管理获得种子。用所得的种子以 相同的浸灌方法再次进行除草剂筛选，对抗性植株 进行 ＰＣＲ 检测。
剂基因作物的大批量筛选工作奠定了基础。