AMPK研究进展

• 2011年7月3日在Cell Metabolism杂志上研究 人员发现了AMPK alpha 2催化亚基上一个新 丝氨酸磷酸化位点serine491，这一位点介导 leptin的抑制作用，并且是leptin影响进食和 体重的关键位点。阻断AMPKα2-serine491的 磷酸化会使下丘脑AMPK活性增强、进食量 和体重增加。 • Leptin影响下丘脑AMPKα2活性、神经肽表 达、进食量和体重都需要Serine491的磷酸化。 • 研究还发现，p70S6激酶是一种AMPK活性 抑制激酶，而AMPK是mTOR-p70S6激酶的 底物。p70S6激酶和AMPKα2形成复合体， 使serine491位点磷酸化。
在体内许多因素，如缺血、缺氧、葡萄糖缺乏、饥 饿、电刺激、热休克， 以及一氧化氮、三羧酸循环 或氧化磷酸化的抑制剂，如亚砷酸盐、抗霉素A、 二硝基苯酚和叠氮化合物等，均导致AMP／ATP比 值显著增高
• AMP激活AMPK的机制可能通过以下3种方式：
(1)AMP直接作用于AMPK，变构激活AMPK； (2)AMPK和AMP结合使之成为其上游激酶 AMPK 激酶(AMPKK)的良好底物和蛋白磷酸酶的不良 底物； (3)AMP直接变构激活AMPKK，后者通过磷酸化作 用激活AMPK。
4、其他
• 目前认为，AMP通过结合AMPK的γ亚单位引 起AMPK的构象改变，一方面可以直接增加 酶的活性(<5倍)，另一方面可以使其构象 改变更有利于AMPK激酶对其磷酸化，进而 增加AMPK活性(50～ 100倍)。 • 所有这些AMP对AMPK的激活作用均可被ATP 所拮抗。
5、AMP通路的调节
• TAK1(TGF-β活化激酶一1)被广泛认为是一种 MAPKK(促分裂原活化蛋白激酶激酶)激酶-7，近来 研究表明其在AMPK活化通路中具有中枢般的调节 作用。 • 研究表明，体外TAK1(TGF-β-activated kinase1)[也就是MAP3K7(MAPKK kinase-7)]，以及TAK1 相关蛋白TAB1能够使Thr172磷酸化，激活AMPK， 从而被认为是一种新的AMPKK。 • 当TAK1缺乏时，LKB1也有一定的活性，提示除了 TAK1对AMPK的直接激活作用外，还可能存在着其 他的作用机制。
• β1在肝脏高表达，在骨骼肌中低表达； 而 β2恰好相反。 • γ1、γ2广泛分布于各组织细胞，γ3仅在 骨骼肌中含量较高。 • 在大部分细胞中主要以α1、β1和γ1异构 体为主，而在肝细胞和脑中α2 表达较高， 骨骼肌和心肌中α2、β2和γ2 γ3 则均有 表达。
三 AMPK活性的调节
• AMPK是一种高度保守的丝氨酸／苏氨酸 蛋白激酶。目前，据研究发现至少有3种 AMPK的上游激酶，分别为LKB1、AMPKK、 TAK1和CaMKK。 • 其AMPK活性调节非常复杂，它可被5‘AMP别构激活以及被磷酸肌酸别构抑制，也 可被其上游的AMPK激酶(AMPKK)激活，它们 的作用位点都是磷酸化AMPKα亚基172位苏 氨酸 。
3、激活剂
• AMPKK和AMPK可被5一氨基咪唑-4-甲酰胺核 糖核苷酸(AICAR)激活。AICAR能被细胞摄 取，在腺苷激酶的磷酸化作用下形成一磷酸 衍生物ZMP(5-aminoimidazole-4Carboxamide-1-β-D-ribofuranosy1-5monophate)，ZMP具有AMP样作用，可激活 AMPK。 • Jorgensen等发现AICAR激活AMPK并诱导骨 骼肌细胞摄取葡萄糖，只与AMPKα2亚基密 切相关，与 α1 亚基无关；而肌肉收缩诱 导AMPK活化与AMPK α1 、 α2亚基均有关。
• γ 亚基的N端区域在大小和序列上变化较大 ，与 γ 1相比， γ 2和 γ 3的N端区域较 长。γ亚单位有4个串行重复的CBS(胱硫醚 β-合酶:cystathionine-β-synthase，CBS） 结构域。 γ 亚基含有两个能结合激活性核 苷酸AMP和抑制性核苷酸ATP的调节位点。 • AMPK以异源三聚体形式广泛存在于哺乳动物 的各种真核细胞种类，这种保守的三聚体形 式是该酶的结构和功能所必需的。AMPK亚单 位在不同组织器官的分布不同，所形成的三 聚体亦各异，可能与组织特异性靶分子的调 节有关。 • γ亚基的N端乙酰化，也增加了AMPK调节的复 杂性。
一 AMPK的结构
Fra Baidu bibliotek• AMPK是一个异源三聚体蛋白，由α(63kD)、
β (30kD)和γ (37-63kD) 3个亚单位 组成。其中， α亚单位起催化作用， 而β和γ亚基在维持三聚体稳定性和作用 底物特异性方面起重要作用。 每个亚 单位都存在由2-3种基因所编码的异构 体(α1， α 2、β1， β2和γ1， γ2 γ3)，从理论上来讲， α、β和 γ 的不同异构体可形成各种可能的组 合,可能有12种。
• β亚单位则好似一个支架，它可把α和γ 亚单位连接起来。 β亚单位N末端区域之 后紧跟着两个保守的结构域——KIS和ASC， ASC结构域为形成稳定有活性的αβγ的复 合物所必需，而KIS并不与激酶的其他亚基 相互作用。KIS结构域序列与“N-异淀粉酶 结构域”序列密切相关，为β亚基上的功 能性糖原结合结构域。其功能可能与糖原 对AMPK的调节有关。 • β亚基的N端豆蔻酰化和磷酸化，这些翻译 后的修饰，调节酶活性和亚基的细胞定位.
二 AMPK的组织分布
• AMPK各亚基的组织分布不同。α1分布很广， 主要分布于肾、肝、肺、心脏和脑； α 2主 要分布在骨骼肌、心脏和肝脏。已证实α 2 亚基也存在于脑神经元中，而且α2亚基含量 明显高于α1亚基。研究还发现α1定位于胞 质，而α2主要定位于胞核，提示在有ATP损 耗的细胞应激反应中，AMPK-α2复合物的核 定位可能至少部分通过磷酸化转录因子，调 节基因表达。
• LKB1 发 挥 作 用 还 必 须 有 两 个 附 属 蛋 白 质 的 共 同 存 在 ： STRA D 和 M O 2 5 。 STRA D (STE20 related adaptor protein)是 LKB1 特 异 性接 头 蛋 白和底 物 ，M O25(mouse protein 25) 主要 参 与 LK B1 的 调 节 ， 它 通 过 结 合 到 STRAD 的 羧 基 端 从 而 发挥 稳 定 STRAD 和 LKB1 复 合 物 的功 能 • LKB1不仅活化AMPK，还激活AMPK亚家族的多 种激酶。相应地，这些激酶参与介导LKB l的磷酸 化效应，包括其肿瘤抑制功能。
Regulation of AMPK activation.
LKB1的结构及组织分布
• LKB1基因定位于人19p13．3， 整个基因跨 度为23 kb。LKB1蛋白由433个氨基酸残基组 成(鼠类的LKB1有436个氨基酸残基)，分子 量为50 kD，具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶 功能. • LKB1广泛分布于人体多种组织中. ，发现几 乎所有组织均有表达，其中成人以上皮、睾 丸生精小管和肝脏的表达最强， 而胎儿组 织中又高于成人；肿瘤组织中的表达高于相 应的正常组织.
LKB1的活性调节
• LKB1的激酶催化域位于第44-309位氨基酸残基。在 LKB1的433个氨基酸残基中，第1-346氨基酸残基是 维持其激酶功能所必需的， 其中第38-43氨基酸残 基为LKB1的核定位信号序列(nuclear localisation signal，NLS)。LKB1通过NLS定位于细胞核，通过与 LIP1(LKB1 interacting protein一1)作用而锚在细 胞质. • 在某些特定细胞(如神经元，内皮细胞，淋巴细胞 等)，AMPK也能被Ca2+ 和AMP依赖的磷酸化激活，这 一过程中的上游激酶是CaMKKβ。 • AMP可以加强LKB1／STRAD／M025复合物对完整AMPK 三聚体的磷酸化，但是不能加强该复合物对分离的、 单个的AMPKα亚基的磷酸化。
• CaMKK(钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶)也能 够调节AMPK的活性，CaMKK主要存在于神经 系统 ，其对Thr172的磷酸化不依赖于AMP浓 度的升高，而是通过增高Ca2+浓度从而激活 AMPK。其调节是通过细胞内钙离子浓度的升 高而启动。
2、通过AMP／ATP比值调节
• AMPK的活性主要受细胞中AMP／ATP比值和肌酸／磷 酸肌酸比值的升高的调节。在生理情况下，为了维 持基本的代谢需要，细胞中维持着高浓度的 ATP水平。 在多数真核细胞中，ATP／ADP的比值约为10：1，而 且在很小的范围内变化。在腺苷激酶的作用下 2ADP←→ ATP+AMP，因而AMP／ATP比值是ADP／ATP 的级数，而且比后者的比值变化更为敏感。当细胞 受到任何引起ATP生成减少，消耗增加的应激刺激时， AMP／ATP比值增加，AMPK则被激活。因而，AMP是调 节AMPK的关键，但AMP是如何调节AMPK的机制尚不完 全清楚。
AMPK研究进展
• 腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是丝，苏氨酸蛋白 激酶,一种重要的蛋白激酶，主要协调代谢 和能量的需要。
• 短期效应能调节能量代谢，长期效应能调 节基因转录。
激活AMPK，一方面关闭消耗ATP的合成代谢 途径； 另一方面启动产生ATP的分解代谢 途径，故被称为“细胞能量调节器”。能 够 调节 机体 的能量代 谢 ， 维持 能量 的 供 求平 衡。 近年来， 随AMPK研究的深入，发现其下游 靶蛋白种类和数量众多， 具有多种重要的 生物学效应。能改 善代 谢综 合 征 ， 故 使其受到越来越广泛的关注。
⑴ Leptin（瘦素）在调节摄食、能量消耗和神经内分泌功能方 面起重要作用。最近研究表明，leptin选择性激活骨骼肌中的 AMPK a2亚基，早期激活是leptin对肌肉的直接作用，在骨 骼肌瘦素可直接激活AMPK活性进而抑制乙酰COA羧化酶 (ACC)活性，加速脂肪酸的氧化作用，减少甘油三酯的沉积。 同时其在肝脏中对糖脂代谢调节亦是通过激活AMPK来发挥 作用，而且依赖于酪氨酸激酶(JAK2)信号通路发挥作用的。 瘦素对胰岛素分泌的影响的研究结论仍不同，但可以肯定的 是AMPK的激活能抑制胰岛素的释放。 而其后的激活作用则有赖于下丘脑．交感神经系统轴，但在 下丘脑中leptin抑制AMPK活性，引起摄食减少和体重下降。 瘦素在不同组织对AMPK的影响不同的原因有待于进一步研 究，推测可能由于不同组织AMPK各亚单位表达以及其上游 激酶LKB1、钙调节蛋白激酶的表达差异造成。
1、AMPK的上游激酶
• LKB1最早发现于Peutz—Jegher综合征(（色 素沉着息肉综合征）的研究中，是人体细胞中 一个抑癌基因，又 叫 STK11(serine／ threonine protein kinase 11)， 是 由 lkb基 因 编码 的 丝 氨 酸／苏 氨 酸蛋 白激 酶 家族 的 成 员 ， 是 一 种 抑 癌 因 素， 其 编 码 的 蛋 白质 称 为 LKB1／STK 11. • 它可以直接磷酸化AMPKα亚单位上的172位 苏氨酸而激活AMPK 。
• AMPKα含有548个氨基酸，可分为催化区N末 端(1～312AA)、是起催化作用的核心部位， 含有一个典型的丝，苏氨酸蛋白激酶的催化 区域，中间一个自动抑制区(312～392AA)和 C末端一个亚单元结合区域(392～548AA)含 有变构结合位点，参与和AMP的结合。 • α亚单位中的8个位点(苏氨酸172、苏氨酸 258、丝氨酸485等)均可被磷酸化，其中苏 氨酸172位点及其磷酸化对AMPK活性的调节 起重要作用。研究中所检测的总AMPK及活性 AMPK蛋白通常是指其α亚单位，
⑵ Adiponectin（脂联素）是一种由脂肪细胞产生的抗糖尿 病胰岛素抵抗和抗动脉粥样硬化的细胞因子。 adiponectin 激活AMPK，进而激活其下游靶点MAPK，增 强PPARα转录活性及靶基因的表达，促进骨骼肌脂肪酸 的氧化,降低脂质在骨骼肌的堆积，同时减少游离脂肪酸 进入肝脏，改善肝脏的胰岛素抵抗，从而降低肝糖的生成 和极低密度脂蛋白的合成。刺激骨骼肌脂肪酸氧化和葡萄 糖摄取，抑制内源性葡萄糖产生以及抑制平滑肌细胞增殖， 有抗糖尿病及抗动脉粥样硬化作用。 脂联素介导的AMPK通路还可与其它信号通路相互作用， 减弱mTOR信号通路，有效阻止mTOR介导的IRS-2的降 解。 近年发现，adiponectin通过激活AMPK在促进新血管生成、 抑制内皮细胞凋亡方面发挥积极作用 ，但其激活AMPK的 具体信号转导机制仍不清楚。 ⑶ ghrelin (脑肠肽)是近年来发现的一种肽类激素，是生 长激素促泌物受体(GSH-R)的内源性配体。研究发现活体 注射ghrelin能够刺激下丘脑AMPK的激活。