iCelligence 基本实验方案

iCELLigence 基本实验方案

艾森生物

iCELLigence系统的核心技术原理及基本应用概况

细胞生物学是通过研究细胞的结构与功能阐明其生命活动基本规律的科学。细胞生物学的主要研究内容包括基因，信号传导，细胞生长、分化和发育的分子机制及其遗传控制，细胞识别及免疫及分子细胞生物学。

目前大部分细胞学研究的检测形式多是终点检测法，仅仅给实验提供了一个最终结果，而且经常需要标记和破坏细胞。但因为细胞是活体，生物和细胞进程是动态而非静态的，终点检测法大大局限了生物信息的全程动态收集。iCELLigence系统的开发和应用解决了传统细胞检测的局限性。iCELLigence的核心技术是基于非标记、动态实时细胞分析检测。该技术采用微机械加工技术, 在细胞培养板的每个细胞生长孔的底上设计了金微电极阵列，用以构建能实时、连续、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗测试传感器，贴壁生长在微电极表面的细胞可引起贴壁电极界面阻抗的改变，从而可以获得细胞生理功能相关的生物信息。

iCELLigence系统的检测优势包括：

• 高信息量：可连续检测生物反应的全过程，提供大量重要的动态反应信息。

• 无标记：分析无需昂贵的标记或报告。

• 无创伤：电子检测不会干扰细胞生长和分析。

• 高准确度和精确度：定量衡量细胞生长，提供高于2个数量级的动态范围，孔对孔CV通常低于10％。

• 自动实时检测：整个实验过程自动收集数据，实时分析，大大改善仅仅在最终点分析的结果。

• 灵活性：独特的设计允许自定义分析项目，提高实验室的效率。

• 易操作：用户友好的软件，简单直接的安装，简化培训和操作。

• 活细胞品质控制：在培养孔中检测细胞质量。

基于iCELLigence系统的检测优势，目前开发的一系列应用包括：细胞质量控制；细胞增殖；化合物、细胞和病毒介导的细胞毒性；细胞粘附和扩展；细胞迁移和浸润；IgE介导的肥大细胞致敏活化及脱颗粒；受体介导的信号通路传导 (GPCR, RTK)；NK细胞介导的杀伤肿瘤细胞; 病毒CPE及中和实验的监测; 细菌毒素介导的细胞病变的监测; 心脏细胞功能和毒性监测等等。该技术已经在细胞研究中广泛应用，近年的已经在SCI收录的杂志上发表的文献已达200多篇。

实验方案:

实验1 –细胞增殖实验

实验2 –化合物介导的细胞毒性检测

实验3 –细胞黏附实验

实验4 –配体-受体相互作用介导的信号转导

实验1. 细胞增殖实验

1. 概述

细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞；细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。传统方法测定细胞生长曲线一般利用细胞计数法进行，实验过程繁琐且耗时（见附件），使用iCelligence实时细胞分析系统方便实时地动态监测细胞贴壁和增殖过程。

2. 实验目的

检测细胞的增殖曲线，在实验开始后观察细胞在xCELLigence系统上的增殖生长过程，并以该曲线为基础，判断细胞的质量。

3. 实验材料

细胞株

∙A549 (ATCC: Cat No:CCL-185™): 人非小细胞肺癌细胞(株)

仪器设备:

∙CO2培养箱及其它细胞培养设备

∙iCELLigence 系统

∙E-Plate L8细胞培养板

试剂:

∙A549细胞培养基: F-12K Nutrient Mixture(Gibco; Cat No. 211127)containing 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco; Cat No. 16000-044),

∙1%Penicilline-Streptomycin solution (Gibco; Cat No. 15140-122)

∙0.25%/Trypsin/EDTA solution (Gibco; Cat No. 25300－054)

∙Phosphate buffered saline (PBS， Hyclone ; Cat No. SH30256.01B）

4. 实验操作流程:

4.1 细胞悬液准备：

4.1.1 在超净工作台内，于无菌条件下，吸除培养皿内旧培养液。

4.1.2 以PBS液清洗1-2次，于培养皿内加入1mL（T75培养瓶）含EDTA的胰蛋白酶溶液。盖好盖，置37˚C温箱中温育2-6 min后，在倒置显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞质回缩，细胞间歇增大，终止消化。

4.1.3 轻轻吸除消化液，加入培养基10mL/培养瓶，用移液管反复轻轻吹打贴壁的细胞，使它们形成细胞悬液。将细胞悬液转移到50mL离心管中，1000 x rpm 离心 5 min，去除上清，加入新鲜培养基，并用移液管将细胞吹打均匀。用计数板计数细胞悬液浓度后，配制成实验细胞浓度为2×105/ml；1×105/ml；0.5×105/ml；0.25×105/ml。

4.2 使用iCelligence系统进行检测:

4.2.1在E-Plate L8的孔中加入150 µl 培养基。

4.2.2将E-Plate L8放到iCelligence 系统上，系统会自动进行扫描，检查是否接触良好，若接触良好则可进行下一步。

4.2.3点击主页上“New Experiment”，进入“Protocol”页面，选择需要进行的实验类型“Cell QC”，选择“Standard Protocol”，确定实验流程。

4.2.4 点击“Layout”页面，设置实验孔的细胞名称、数目。

4.2.5 点击左下角开始的标志，开始检测基线。

4.2.6取出E-Plate L8，在孔中加入300 µl 混合均匀的A549细胞悬液，使每孔中细胞数目为

60,000；30,000；15,000；7,500 cells。

4.2.7将E-Plate L8置于超净台中室温放置30min。

4.2.8将E-Plate L8放到培养箱中的iCelligence上。

4.2.9在系统自动扫描“Scan Plate”后，开始Step2检测细胞增殖曲线。

5. 典型结果及数据分析:

不同密度梯度A549细胞的增殖曲线：