Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础_藏雨轩

2014年11月第34卷第11期

基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine November 2014Vol．34No．11

收稿日期：2014-02-12

修回日期：2014-08-25

基金项目：国家自然科学基金（81202031）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2013-351）；2013年吉林省大学生创新创业训练计划（856号）；吉林医药学院大学生科研项目［吉医学科字（2012）第12号］

*

通信作者（corresponding author ）：haof863@126．com

文章编号：1001-6325（2014）11-1477-05

研究论文

Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础

藏雨轩1

，方

芳2，朱杭飞2，向国艳1，张雲乔1，李瑷彤1

，郝

峰

1*

（吉林医药学院1.生物化学检验教研室；2.免疫学教研室，吉林吉林132013）

摘要：目的探讨Ano2是否为钙激活氯离子通道的分子基础。方法用ＲT-PCＲ技术扩增Ano2编码基因，将Ano2

连接到真核表达载体pEGFP-N3；通过脂质体介导将Ano2转染至FＲT 细胞，抗生素筛选获得稳定表达Ano2的细胞系；倒置荧光显微镜下观察Ano2在FＲT 细胞中的表达和分布，

Western blot 检测Ano2的表达；全细胞膜片钳技术研究Ano2的电生理学特性。结果成功构建pEGFP-Ano2真核表达载体；Ano2表达在FＲT 细胞膜上；Ano2电流呈Ca 2+、时间和电压依赖性，电流和电压关系呈外向整流。结论Ano2是钙激活氯离子通道的分子基础。

关键词：Ano2；FＲT 细胞；转染；钙激活氯离子通道

中图分类号：Q 424

文献标志码：A

Ano2is the molecular identity of calcium-activated chloride channels

ZANG Yu-xuan 1，FANG Fang 2，ZHU Hang-fei 2，XIANG Guo-yan 1，ZHANG Yun-qiao 1，

LI Ai-tong 1，HAO Feng 1*

（1.Dept．of Biochemistry Laboratory ；2.Dept．of Immunology ，Jilin Medical College ，Jilin 132013，China ）

Abstract ：Objective To investigate that whether Ano2is the molecular identity of calcium-activated chloride channels．Methods

The full length coding sequence of Ano2was amplified by ＲT-PCＲ，Ano2and eukaryotic ex-

pression vector pEGFP-N3were ligated ；Then recombinant plasmids were transfected into FＲT cells using liposome ，and the stable transfection FＲT cells were selected with antibiotic ；the expression and location of Ano2was ob-served by the inverted fluorescence microscope and its expression was detected by Western blot ；the electrophysio-logical properties of Ano2were researched by whole-cell patch-clamp technique．Ｒesults

pEGFP-Ano2was suc-cessfully constructed ，FＲT cell membrane expressed Ano2；the electrophysiological properties of Ano2were Ca 2+-，time-and voltage-dependent ，and an outward-rectifying I /V relationship was observed．Conclusions Ano2is the

molecular identity of calcium-activated chloride channels．

Key words ：Ano2；FＲT cells ；transfection ；calcium-activated chloride channels

钙激活氯离子通道（calcium-activated chloride channels ，CaCCs ）是一类在内皮细胞、平滑肌细胞和神经元等细胞广泛表达的阴离子通道，在跨上皮液体转运、嗅觉信号传导和平滑肌收缩等多种生理过程中扮

演重要角色

［1-2］

，同时CaCCs 也是治疗高血压、腹泻和

某些特定肿瘤等疾病潜在的药物靶点［3］

。跨膜蛋白16

家族（transmembrane protein 16）共有10个成员，目前已证实Ano1（anoctamin 1）是CaCCs 的分子基础

［4-5］

，但

基础医学与临床Basic＆Clinical Medicine2014.34（11）

对其他成员的作用还不十分清楚。本实验探讨Ano2（anoctamin2）是否是CaCCs的分子基础。

1材料与方法

1.1材料

限制性内切酶、T4连接酶和Taq酶（Takara公司）；引物合成和测序（上海生工公司）；ＲT-PCＲ试剂盒和Trizol（Invitrogen公司）；DNA凝胶回收试剂盒（Qiagen公司）；FＲT细胞（大连医科大学麻彤辉教授馈赠）；兔源增强型绿色荧光蛋白（EGFP）抗体和羊抗兔二抗（中杉金桥公司）；F-12基本培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氯化铯（CsCl）、N-甲基-D葡萄糖胺（NMDG）和尼氟灭酸（niflumic acid，NFA）（Sigma公司）；胎牛血清（四季青公司）。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成：NCBI查询小鼠Ano2基因（NM_153589）序列，设计位于开放读码框架两端的引物，去除下游引物终止密码子后加入保护碱基和相应酶切位点EcoＲⅠ（GAATTC）和KpnⅠ（GGT ACC）。上游引物：5'-CGAATTCCGTCTGAGCCGCA TGCACTTT-3'；下游引物：5'-GCGGTACCTACATTGG TGTGCTGGGACC-3'。

1.2.2ＲT-PCＲ扩增Ano2基因：提取小鼠视网膜总ＲNA，仅转录为cDNA，以此为模板进行PCＲ反应，94ħ预变性5min；94ħ30s，55ħ30s，72ħ3.5min，30个循环；72ħ，10min，PCＲ产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收阳性片段。

1.2.3pEGFP-Ano2的构建、转化与鉴定：EcoＲⅠ和KpnⅠ双酶切Ano2与pEGFP-N3后，16ħ连接过夜。将重组质粒转化入感受态DH5α，次日挑取阳性克隆，摇菌扩增，12h后提取质粒，酶切正确后测序。1.2.4稳定表达pEGFP-Ano2细胞系的建立：将长势良好的FＲT细胞铺6孔板，置于37ħ、5%CO2培养箱培养。待第2天细胞汇合度达80% 90%，将0.5μg质粒分別与1、1.5、2和2.5μL脂质体Li-pofectamine2000，混合进行转染，倒置荧光显微镜观察转染pEGFP-Ano2在Fisher大鼠甲状腺滤泡上皮细胞（Fisher rat thyroid，FＲT）中Ano2的表达情况，选取转染效率高的质粒和脂质体比例进行后续实验。36h后将转染的FＲT细胞消化，按照1ʒ5ʒ10的比例传代到3个10cm培养板中，并加入含有1000ng/mL的G418的完全培养液培养，挑取纯度和表达量均较高的克隆到96孔板继续培养，待细胞汇合度达60%后扩大培养。

1.2.5Western blot检测pEGFP-Ano2的表达：转染后36h，消化收集细胞并超声裂解，将定量的蛋白样品上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，180mA2h电转移至NC膜，脱脂奶室温封闭2h，然后加EGFP抗体、内参β-actin抗体和羊抗兔二抗摇晃孵育，TBST 洗膜3次，ECL（A和B显色液等体积混合）化学发光试剂显影，放入凝胶成像系统中拍照，用Quality one软件分析灰度值。实验数据以均值ʃ标准差（xʃs）表示，应用SPSS13.0软件进行统计分析，组间比较采用t检验。

1.2.6全细胞膜片钳技术记录Ano2的电流：将转染pEGFP-Ano2的FＲT细胞消化置于倒置荧光显微镜载物台，电极给予负压吸引并击破细胞膜，维持GΩ高阻抗封接，形成whole-cell patch。初始钳制电压为0mV，施加从－100mV跃阶到+100mV电压（每20mV一个step），各记录750ms电流变化，750ms后电压变为－60mV，继续记录200ms，CaCCs的抑制剂NFA作为对照。配制600nmol/L Ca2+溶液和0nmol/L Ca2+溶液，配方详见参考文献［6］。

2结果

2.1重组pEGFP-Ano2真核表达载体双酶切鉴定

琼脂糖凝胶电泳结果约在4700、2700、7400、7400和4000bp处有5条清晰带，与预期结果一致（图1）

。

1.Ｒestriction enzyme of recombinant plasmid pEGFP-

Ano2by EcoＲⅠ/KpnⅠ；2.EcoＲⅠsingle enzyme；

3.KpnⅠsingle enzyme；

4.pEGFP-Ano2recombinant

eukaryotic expression plasmid；5.DL5000DNA marker

图1重组质粒电泳图

Fig1Electrophoregram of recombinant plasmid

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