学习手册-谷氨酸提取技术

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《子情境：谷氨酸提取技术》
引导文-单元设计-技能考核标准-实训指导书
子情境：引导文
谷氨酸提取技术
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材料一：谷氨酸发酵液的性质
一、谷氨酸的性质
1、谷氨酸的主要物理性质
谷氨酸结晶为无色正四面体晶体，相对分子质量为147.13，相对密度为1.538 (20℃)，熔点为202～203℃，在2mol/L HCl中的比旋光度为[α]D20=+31.8°(HCl浓度为10%)。

2、谷氨酸的主要化学性质
①成盐反应
谷氨酸分子中含有2个酸性的羧基和1个碱性的氨基，是一个既有酸性基团又有碱性基团的两性电解质，与酸或碱作用都可以生成盐。

②脱羧反应
在谷氨酸脱羧酶的作用下，谷氨酸脱去α-羧基放出二氧化碳，同时生成γ-氨基丁酸。

用瓦勃氏呼吸仪测量二氧化碳的生成量，就可以计算谷氨酸的量，这是测定谷氨酸的方法之一。

③与茚三酮反应
谷氨酸和其它氨基酸一样，在pH2.5～4.7时与水合茚三酮共热，生成紫蓝色产物，其颜色深浅与谷氨酸含量成正比。

在没有其它氨基酸存在时，可利用这个反应来定量分析谷氨酸。

④生成焦谷氨酸
谷氨酸经长时间加热，脱水生成焦谷氨酸(L-吡咯烷酮酸)。

⑤生成谷氨酸盐酸盐
谷氨酸在浓盐酸中会生成并析出谷氨酸盐酸盐。

谷氨酸盐酸盐与碱作用生成谷氨酸。

如果碱过量则生成谷氨酸一钠甚至生成谷氨酸二钠。

⑥与金属盐反应
在一定pH下，谷氨酸与金属盐反应生成难溶于水的复盐。

这个性质也被用于提取发酵液中的谷氨酸。

二、谷氨酸发酵液的性质
谷氨酸发酵属于细菌发酵，培养基的主要成分是葡萄糖、铵离子和磷酸盐等，因此发酵液较稀薄、不黏稠。

发酵结束放罐时，发酵液中除了含有谷氨酸外，还有菌体和培养基的残留物以及其它代谢产物等。

从外观上看，发酵结束时整个发酵液呈浅黄色浆状，表面浮有少许泡沫，发酵液温度一般为34～36℃，pH为6.5～7.0，近中性。

发酵液中的主要成分和含量取决于发酵条件的控制和生产菌种的类型。

发酵液中的主要成分有以下几种：
①谷氨酸
发酵液中所含的谷氨酸均为L-型，一般以谷氨酸铵盐的形式存在，即C5H8O4N·NH4。

谷氨酸的含量一般在12～15%。

②无机盐
发酵液中含有的无机盐主要是K＋、Na＋、NH4＋、Mg2＋、Ca2＋、Fe2＋、Cl－、SO42－、PO43－等，此外发酵液中还有残糖、色素等成分。

其中NH4＋的含量占发酵液的0.6%～0.8%，残糖的含量占发酵液的0.8%以下。

③菌体和培养基残留物
大量菌体、蛋白质等固形物质悬浮在发酵液中，其中湿菌体占发酵液的8%左右。

此外，在发酵过程中用于消泡的合成消泡剂等也留在发酵液中。

④发酵副产物
发酵液中还有一些含量很少的发酵副产物存在，如有机酸类主要有乳酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等；氨基酸类有天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、组氨酸和谷氨酰胺等；各种氨基酸的含量均小于1%。

此外，发酵液中还含有核苷酸类物质及其降解产物，以腺嘌呤和尿嘧啶较为常见。

其中腺嘌呤在发酵液中占0.02%～0.05%，而尿嘧啶占发酵液的0.01%～0.03%。

完成下列信息！
谷氨酸具有哪些性质？----------------------------------------------------
材料二：谷氨酸提取的常用方法：
1、等电点法
利用谷氨酸是两性电解质的性质，将发酵液加硫酸调pH至谷氨酸的等电点，使谷氨酸沉淀析出。

2、离子交换法
先将发酵液稀释至一定浓度，用盐酸或硫酸将发酵液调至一定的pH，采用阳离子交换树脂（732#）吸附谷氨酸，然后用洗脱剂将谷氨酸从树脂上洗脱下来，达到浓缩和提纯谷氨酸的目的。

3、金属盐法
利用谷氨酸与Zn2＋、Ca2＋等金属离子作用生成难溶于水的谷氨酸金属盐而沉淀析出。

④离子交换膜电渗析法
根据渗透膜对各种离子物质的选择透性不同而将谷氨酸分离，如电渗析和反渗透法。

材料三：菌体分离的方法
由于谷氨酸产生菌菌体很小，其大小只有0.7～1.0μm×0.7～3.0μm，比酵母和霉菌菌丝体小得多，因此分离比较困难。

可用于菌体分离的方法如下：
1、机械分离法
一般采用高速离心分离机分离菌体。

如用国产的DP-400型和D-350型酵母高速离心机，转速6500r/min，GF-150型高速管式离心机，转速13500~15000r/min。

但动力消耗太大。

2、加热沉淀法
将发酵液加热至70～80℃，静置使菌体和蛋白质凝固沉淀而除去。

此法特别适用于感染杂菌、污染噬菌体的发酵液，经过加热既可杀死杂菌又可使大量杂质凝固沉淀，有利于提取；但缺点是消耗较多能源，另外发酵液中残糖与谷氨酸发生美拉德反应造成产酸下降和色素上升。

3、添加凝聚剂沉淀法
在发酵液中加入适量的絮凝剂如聚丙烯酰胺，使菌体凝聚一起，加助滤剂过滤除去，但聚丙烯酰胺具有一定的毒性。

4、采用各种膜除去菌体
随着膜技术进步，国内已有厂家采用此技术分离菌体，但存在问题是投资大，另外分离得到的湿菌体中含有大量谷氨酸，如何回收湿菌体中谷氨酸是一大难题。

材料四：谷氨酸溶解度的影响因素
1、pH对谷氨酸溶解度的影响
谷氨酸的溶解度随pH改变而变化。

谷氨酸在pH1附近或碱性情况下，溶解度很大，但是等电点pH3.22和在30%以上的高浓度盐酸条件下，溶解度便显著降低到最低点。

工业生产中的等电点法、盐酸盐法提取谷氨酸，就是巧妙地利用这一特性
2、温度对谷氨酸溶解度的影响
温度对谷氨酸溶解度影响较大，温度越低，溶解度越小，这便是低温等电点法提取谷氨酸能提高收率的依据。

3、杂质对谷氨酸溶解度的影响
发酵液中含有残糖、其它氨基酸、菌体及胶体物质等杂质，这些杂质都会提高谷氨酸的溶解度。

材料五：谷氨酸的结晶
1、谷氨酸的晶型及其性质
谷氨酸结晶具有多晶型性质，在不同条件下会形成不同的谷氨酸结晶，可分为α-型结晶和β-型结晶二种。

α-型谷氨酸结晶为正四面体，是等电点提取的一种理想结晶。

这种结晶纯度高、颗粒大、易沉降，因此容易与母液分离。

β-型谷氨酸结晶为粉状或针状、鳞片状结晶，晶粒微细、纯度低、难沉降，结晶时常与发酵液中胶体物质粘结，悬浮在母液中或搅拌轴周围，不易沉淀分离，故称为轻质谷氨酸（轻质麸酸）。

因此在操作中要控制结晶条件，避免β-型结晶析出。

2、影响谷氨酸结晶的主要因素
影响谷氨酸结晶的因素很多。

发酵液的纯度和中和结晶操作条件是影响谷氨酸结晶的主要因素。

如发酵液中谷氨酸含量、温度、残糖、菌体以及是否染菌(尤其是否染噬菌体)；中和时的加酸速率、搅拌、加晶种与否、晶种质量等，对谷氨酸的结晶及收率都有很大影响。

①谷氨酸含量对结晶晶型的影响
随着发酵液中谷氨酸含量的升高，等电点结晶时如控制不当，生成β-型结晶的机会增多，这样会造成母液分离困难，谷氨酸结晶纯度下降，并影响收率。

②温度与降温速率对晶型的影响
结晶析出温度对晶型有很大影响，当结晶析出温度超过30℃时，β-型结晶明显增加。

因此，为了避免形成β-型结晶，在等电点法提取谷氨酸时，必须先将发酵液的液温降到30℃以下，再进行晶体析出。

中和时要控制液温缓慢下降，不能回升，这样形成的谷氨酸结晶颗粒较大，否则降温过快或温度忽高忽低时，不仅晶核小而多，而且会引起α-型结晶向β-型结晶转换。

中和结束育晶2h后，温度应尽可能降低，以减少谷氨酸的溶解。

③加酸速率与终点pH的控制
加酸的目的是调低发酵液的pH，最后使其达到谷氨酸的等电点。

要缓慢加酸，pH缓慢下降，不能回升。

使谷氨酸的溶解度逐渐降低，晶核一旦形成也不会太多。

控制一定数量的晶核，经停酸育晶和养晶阶段，使其成长壮大，析出大颗粒
的α-型结晶。

通常开始加酸中和到pH4.8～5.0，这段过程加酸速率可稍快，至育出晶核后，加酸速率要缓慢，直到中和到等电点pH3.0～3.2。

等电点终点pH要准确，才能使谷氨酸的溶解度达到最低，一次收率才会提高。

由于谷氨酸溶解度在等电点偏碱时比偏酸时增加幅度大，为了防止目视和仪器测定的pH所造成的误差，pH应调在3.0～3.2范围内，待停酸半小时搅拌均匀后，再取样测定，中和结束后2～3h内，再取样复测，如发现pH变化，需及时调整。

谷氨酸发酵时，NH4+不能过高，pH不能偏低，以防止谷氨酸向谷氨酰胺转化。

发酵液放罐时，有时pH是正常的，但搁置过久，尤其是气温高的季节，由于环境中酵母等杂菌的作用，pH会降低。

当pH6左右时是谷氨酰胺合成酶的最适pH，酶活力增高，谷氨酰胺积累量就会增加，所以供提取的发酵液应尽量新鲜，不要放置时间过长。

3、投晶种与育晶
①投晶种
在正常的发酵液中，采用等电点法提取谷氨酸，当产酸在8%以上时，可以采用一次冷冻等电点法（0～4℃），在不加晶种情况下，收率也可达85%以上。

但从谷氨酸晶体生成的动力学角度上来看，添加晶种能防止突然产生过多的晶核而发生聚晶现象。

投放晶种有二种方式，即在出现晶核前投入；或在出现少量晶核后投入。

按结晶理论，溶液在变为饱和时，经历介稳区和不稳区二个区域。

介稳区决定晶体的成长，不稳区决定晶核的形成，故投晶种时应控制在介稳区。

利用调节pH 与温度两个手段，使谷氨酸处于介稳区。

一般投晶种量为发酵液的0.2~0.3%。

②育晶
谷氨酸发酵液在正常情况下，其放罐pH一般在6.5～7.0之间。

当发酵液泵入等电点罐后，其温度冷却到28℃左右，第一步就加酸调至育晶点。

通常发酵产酸高，育晶点的pH也高。

确定育晶点pH，要仔细观察晶核生成情况，当手触、目视发现晶核时，这时的pH就可作为育晶点，停止加酸进行育晶，以利于必要的养晶过程，育晶时
间一般为2个小时，使谷氨酸晶核成长壮大，形成较大的结晶颗粒。

4、搅拌的影响
搅拌的作用是使液体不断地翻动，使温度和pH保持均匀，以有利于晶体长大，避免晶簇的形成。

但搅拌速率不能太快，液体翻动太激烈，对晶体长大不利，促使晶体细小。

搅拌太慢，液体翻动过慢，温度和pH不均匀，造成局部pH过低，易形成细微的晶核甚至轻质谷氨酸。

搅拌速率与设备的直径和搅拌叶大小有关，设备越大，搅拌器的转速也应适当降低，其转速以30 r/min左右为宜。

5、菌体的影响
发酵液中菌体直接影响谷氨酸结晶。

用等电点法沉淀谷氨酸结晶时，菌体也随之沉降于结晶上层，不易与谷氨酸分离。

菌体经分离后其收率可提高5%左右。

谷氨酸发酵液中菌体数量和菌体大小由菌种和采用发酵工艺的不同而有所区别。

如AS1542、B9系列菌种，发酵后菌体的数量少、菌体较大而相对密度又小，沉降速率很慢，易于与谷氨酸结晶分离。

而AS1299、7338和T6-13系列菌种，发酵后菌体数量多、菌体较小而又重，沉降速率快，与谷氨酸结晶较难分离，影响提取收率，所以采用这类菌种发酵时，必须控制有关工艺条件，使其有利于提取，以获得较高收率。

6、杂菌和噬菌体的影响
谷氨酸发酵一旦污染了噬菌体或杂菌后，发酵液色泽变得深灰、有异味，其产酸率和转化率都受到很大影响。

尤其是受噬菌体侵入，寄主谷氨酸产生菌因噬菌体发生溶菌作用，细胞核物质破坏，细胞壁破裂，菌体内含物渗出，发酵液中胶体物质大量增加，泡沫多、残糖高，等电点时极易形成β-型结晶，杂质与胶体物质结合形成轻质谷氨酸，严重时成浆状。

7、氨基酸和多肽类物质的影响
①氨基酸对晶型的影响
谷氨酸结晶过程中，如有L-型的天门冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸和胱氨酸等氨基酸存在时，能改变β-型结晶长短轴比，促使转向α-型结晶的形成。

因此在谷氨酸结晶处于不良状态时，容易形成β-结晶时，可以添加一些蛋白质水解液或含有其它氨基酸较高的离交后流分、结晶母液等，以促进α-型结晶析出和提高得率。

②多肽对结晶的影响
谷氨酸结晶过程中添加少量多肽类物质，也有利于α-型结晶析出。

③谷氨酰胺对结晶的影响
发酵液中的谷氨酰胺对谷氨酸结晶影响很大。

当谷氨酰胺含量大于0.25%时，就会影响谷氨酸α-型结晶的形成，含量越高，转向β-型结晶越多，所以在谷氨酸发酵过程中要控制谷氨酰胺形成。

8、原辅材料对提取的影响
9、其它影响因素
谷氨酸发酵时，由于泡沫大，消泡剂加量过多，当大于0.06%时不利于谷氨酸提取。

发酵液中酮酸含量过高，当大于0.1%时，也会影响谷氨酸的提取。

材料六：等电点工艺类型
国内谷氨酸发酵采用等电点提取工艺，归纳起来有带菌体直接常温等电点、带菌体冷冻低温一次等电点、除菌体常温等电点、浓缩水解等电点和低温浓缩等电点等。

从结晶方法分为逐步起晶法和连续结晶法（即当量中和法）。

材料七：直接常温等电点法工艺
1、工艺流程
发酵液
↓加盐酸调pH5.0~5.5(出现晶核为准)
育晶2~4h
↓加盐酸调pH3.5~3.8
育晶2h
↓加盐酸调pH3.0~3.2
搅拌16~20h
↓
沉淀2~4h
↓离心分离
↓↓
湿谷氨酸结晶上清液(经离子交换回收谷氨酸)
2、操作要点：
①将放罐的发酵液先测定放罐体积、pH、谷氨酸含量和温度，开动搅拌。

若放罐的发酵液温度高，应先将发酵液冷却到25～30℃，泡沫消除后然后再开始调pH。

②用盐酸调pH5.0～5.5(根据发酵液的谷氨酸含量高低而定），此前的加酸速率稍快，影响不大。

③当pH达到5.0左右时，应放慢加酸速率，在此期间应注意观察晶核形成的情况，若观察到有晶核形成时，应停止加酸，搅拌育晶2～4h。

若发酵不正常，产酸低于4%时，虽调pH4.0，仍无晶核出现，遇到这种情况可适当将pH降至
3.5～3.8左右，搅拌2h，以利于晶核形成或者适当加一点晶种剌激起晶。

④搅拌育晶2h后，继续缓慢加酸，耗时4~6h，调pH3.0～3.2，停酸复查pH，搅拌2h，开大冷却水降温，使温度尽可能降低。

⑤达到等电点pH后，继续搅拌16h以上，停搅拌静置沉淀4h，关闭冷却水，将上层菌体液放至近谷氨酸层面时，用真空将谷氨酸表层菌体和细谷氨酸抽到另一容器里回收。

取出底部谷氨酸，离心甩干，水洗谷氨酸，可改善谷氨酸的质量和色泽。

材料八产品的含量测定
一.谷氨酸的检测
1.原理：
茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。

氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。

该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm 处的光密度，测定氨基酸的含量。

2.试剂与材料
（1）标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L 溶液。

（2）pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L 醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。

用pH 检查校正。

（3）茚三酮显色液：称取85mg 茚三酮和15mg 还原茚三酮，用10mL 乙二醇甲醚溶解。

茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g 茚三酮溶于15～25mL 热蒸馏水中，加入0.25g 活性炭，轻轻搅拌。

加热30min 后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。

次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL 冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

还原型茚三酮按下法制备：称取5g 茚三酮，用125mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。

将5g 维生素C 用250mL 温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C 溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。

滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3 次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。

乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL 乙二醇甲醚中加入5g 硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。

（4）60％乙醇。

（5）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。

（6）分光光度计。

（7）水浴锅。

3.操作步骤
①标准曲线的制作
分别取0.3mmol/L 的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于试管中，用水补足至1mL。

各加入1mL pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。

放置5min 后，加入3mL60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。

（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。

以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

②氨基酸样品的测定
取样品液1mL ，加入pH5.4，2mol/L 醋酸缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL ，混匀后于100℃沸水浴中加热15min ，自来水冷却。

放置5min 后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD 570nm （生成的颜色在60min 内稳定）。

4.将样品测定的OD 570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。

5.计算结果
1000
)/(570对应标准曲线查得值
氨基酸含量nm OD L mmol
完成以下信息：
谷氨酸含量测定的方法有哪些？并简述这些方法的特点。

谷氨酸发酵生产技术-谷氨酸提取技术
学习情境设计方案
《谷氨酸发酵生产技术-谷氨酸提取技术》技能考核标准
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实训计划。