遗传学实验教程_百替生物

遗传学实验教程

主 编 徐振平

副主编 范雪辉 陈伟

王树芳 杨述芳

新乡医学院生命科学技术系

目录

实验一人类染色体标本制备 (1)

实验二人类某些遗传性状（疾病）的调查分析 (5)

实验三人类性染色质标本制备技术 (9)

实验四染色体显带与染色体高分辨显带技术 (12)

实验五核型分析与人类异常核型观察分析 (22)

实验六蚕豆根尖孚尔根（F e u l g e n）染色法） (31)

实验七诱变物质的微核检测技术--蚕豆根尖微核检测 (33)

实验八果蝇的形态、生活周期及其饲养.....................................................................3 5 实验九果蝇唾腺染色体制片与观察 (38)

实验十花粉活力的碘-碘化钾染色测定 (40)

实验十一大蒜根尖细胞多倍体的诱导和观察 (41)

实验十二荧光原位杂交技术 (43)

实验一人类染色体标本制备

人体内任何旺盛有丝分裂的细胞或者在体外适当培养下能旺盛分裂的组织细胞群，均可作为细胞遗传学研究的材料，用于制备染色体标本。常用的材料有外周血淋巴细胞、骨髓细胞、羊水细胞、绒毛细胞、胸腹水细胞、性腺活检组织、精子、实体瘤组织，以及皮肤、肝和肾等组织。这些材料按下述方法进行处理后，都可作为研究人类染色体的材料，用于染色体病的诊断和产前诊断等。

【实验目的】

了解和掌握外周血细胞培养试剂的配制和消毒方法；学习、掌握培养细胞的染色体制备的一般方法，掌握人类染色体的一般形态结构。

【实验器材和试剂】

1．仪器设备超净工作台、带有照相装置的光学显微镜、隔水式恒温培养箱或CO2培养箱、恒温水浴箱、电热干燥箱、离心机、冰箱、分析天平（1/10 000）或电子天平、普通天平、高压蒸气灭菌锅、小型真空泵、电吹风、pH计、定时钟、秒表。

2．器材 G6型玻璃漏斗（细菌滤器）、蒸馏水瓶、蒸馏水器、10ml刻度离心管、10ml培养瓶（或青霉素小瓶、带瓶塞）、2ml注射器、吸管、滴管、烧杯、量筒、锥形瓶、试管架、三角烧瓶、染色缸、酒精灯、各种试剂瓶、载玻片、镊子、吸水纸、洗耳球、搪瓷盘、铝制饭盒、酒精棉球、碘酒棉球以及包布等。

3．试剂 RPMI-1640培养液（含10％～20％小牛血清）、NaHCO3、PHA、青霉素、链霉素、肝素溶液、秋水仙素或秋水仙胺、1mol/L HCl、双蒸水（ddH2O）、0.075mol/L KCl、甲醇、冰醋酸、Giemsa 染液液、pH6.8的PBS。

【实验内容与方法】

外周血的淋巴细胞在体内外一般是不分裂的，它们都处于间期的G0或G1期，故在未经培养的外周血中很难见到正在分裂的淋巴细胞。1960年Nowell发现从芸豆（phaseolus vulgaris）中提取的能使红细胞凝集的物质——植物血球凝集素（phytohemgglutinin，PHA）可以刺激淋巴细胞，使其转化为幼稚的原始细胞样（blast like）的细胞淋巴母细胞而具有重新分裂的能力。以外周血为材料制备淋巴细胞染色体标本由于具有取材方便、用血量少（0.3～1.0ml）及容易培养、培养时间短即可得到大量有丝分裂相等优点，故该方法在国内外的有关实验室中以及临床上被广泛应用，细胞遗传学领域中几乎90%以上的研究取材于外周血。按容器是否密闭，培养方法可分两种：一种是使用二氧化碳培养箱，培养容器不需密闭，用循环的5%的CO2调节培养基的pH；另一种是使用普通的恒温箱，培养瓶口要密封或用瓶塞塞紧。后一种在一般实验室内即可做到。此外，按培养的血量或淋巴细胞数目，可分标准法、半微量或微量全血法（whole blood microculture）两种。

微量全血方法采血量少，尤其在对小儿、新生儿的研究中更为适用。在需要大量染色体标本（如进行G、Q显带的研究）以及需要积累大量有丝分裂细胞，尤其是早期分裂细胞（如高分辨染色体的研究）时，标准培养法仍然适用。

淋巴细胞在体外培养至72小时左右时，大多数细胞已处于第二次增殖周期内，在收获细胞前加入一定量的秋水仙素或秋水仙胺将细胞阻止于有丝分裂中期，可导致积累大量含有可见的中期染色体的细胞，然后将细胞悬液离心、低渗和固定处理，最后将细胞悬液滴于湿冷清洁的玻片上。空气中自然干燥即得可供分析的中期染色体标本。从染色体标本中不仅能精确计数染色体的数目，而且能用来检验个别染色体畸变（变异）。近年来，由于各种显带技术与高分辨染色体技术的问世与不断改进，使淋巴细胞培养已成为遗传学研究中的一种常用方法。

一人外周血淋巴细胞培养

以半微量全血法为例，有关器械的清洗和消毒、细胞培养用液的配制及消毒见附录。

1．采血用一次性2ml注射器抽取肝素稀释液0.2ml，湿润针管，然后将多余的肝素排除。以碘酒及酒精清洗并消毒供血者肘部皮肤，用橡皮管结扎静脉回流的上端，将肝素预先润湿的注射器刺入肘部静脉，抽取静脉血0.5～2ml，然后转动针管，使血液和肝素混合。

2．接种和培养在无菌室内的超净工作台上，或用酒精消毒培养瓶的翻口瓶塞后插入针头，将抽得的抗凝血迅速接种到5ml含适量PHA（约0.2ml）及小牛血清的培养瓶中，每瓶接种全血0.4ml左右（6号针头15～20滴），轻轻摇匀，置37℃培养箱中培养，根据研究需要与具体情况（如各实验室条件、试剂的影响等）可培养48～72小时，一般有丝分裂的高峰多在培养60～72小时之间。

标准培养法由于用血量大，不易为受检者接受。一般的程序是：取静脉血5～10ml，室温下静置1～2小时，或低速离心（400～500r/min）数分钟。此时可见血浆及介于血浆与红细胞层之间的白细胞层，将血浆及白细胞层吸出混匀，以0.6～0.8ml接种到已配制的混合培养液5ml中，剩余的红细胞层仍可按上述全血法进行培养。

3．积累中期细胞在终止培养前4～6小时，用1ml注射器（装5号针头）加入浓度为5μg/ml 的秋水仙素2滴，使培养液中的秋水仙素终浓度为0.05μg/ml。轻轻摇匀，放回培养箱中继续培养至72小时。加入秋水仙素的目的在于抑制纺锤丝的形成，使细胞分裂停止在中期。以下步骤则不需无菌操作。

二染色体标本的制备

1．收获细胞取出培养瓶，将培养液摇匀后倾入10ml刻度离心管中，在粗天平上配平后放入离心机，以1 000r/min离心8～10min，吸弃上清液，保留细胞悬液约0.5ml。

2．低渗处理往离心管中加入8ml已温浴达37℃的0.075 mol/L KCl溶液，用吸管混匀，置37℃恒温水浴箱中低渗15～25min（精确的低渗时间可自行摸索）。

3．预固定低渗处理完成后，加入1ml新配制的固定液（甲醇∶冰醋酸为3∶1）并用吸管混匀，平衡后放入离心机，以1 000r/min离心8～10min。吸弃上清液。

4．固定加入6ml固定液，用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液，室温下静置20min后，1 000r/min离心8～10min。吸弃上清液。

5．再固定加入4ml固定液，用吸管轻轻吹打使细胞混匀，室温下静止15min或更长时间。（如由于某种原因，不能立即制片时，可将离心管口盖好，置冰箱中过夜或更长时间）。

6．制片将上述细胞混悬液离心（1 000r/min，8min），吸弃上清液，视离心管中沉淀（细胞）