高三生物 基因工程

常用的克隆载体
• 质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的 小型环状双链DNA分子
– 理想的质粒
* 拷贝数多; * 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素 基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶 基因(lac Z) 筛选标志 * 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)
• 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和 切割序列，认为它由5-6个碱基组成 • 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000 碱基的片段。 • 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 • 限制性酶：HindⅡ
3' 5'
C-A-Pu-Py-T-G G-T-Py-Pu-A-C
5' 3'
• 基因克隆示意图
载体DNA ( 限制性内切酶切开)
＋
目的基因
＋
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
表达
基因工程大事记
• 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 • 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上 第一种基因工程蛋白药物 • 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛 素在英、美获准使用 • 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国 转基因鱼
SmaⅠ C C C GGG 3′ 3′ GGGC C C 5′
5′
平头末端 5′ CCC GGG 3′ 3′ GGG CCC 5′
修饰酶
• • • • • DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) • Taq DNA聚合酶
* 胰岛素 * 人生长激素 * 干扰素 * 白细胞介素2 * 粒细胞集落刺激因子 * 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 * 红细胞生成素 EPO * 组织纤溶酶原激活剂 * 生长激素 * 促生长素 * 抗血友病因子Ⅷ * 脱氧核糖核酸酶 * 葡糖脑苷脂酶 * 鼠单克隆抗体
自然界的基因转移和重组
• 基因重组(genetic recombination)——整 段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种 间进行交换,并能在新的位置上复制,转录 和翻译 • 自然界的基因转移和重组是无目的 • 基因工程有目的
• • • • • 工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 真核细胞转染 克隆基因的表达
工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶
cDNA合成
5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾
• 结合作用
– 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个 细胞（细菌）
• 转化作用 transformation – 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使
细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的 过程
转导作用 transduction
• 病毒、噬菌体介导
– 溶菌途径；溶原菌途径
溶原
裂解
基因工程
DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ)的活性
• 5′至3′的聚合活性
– 5′→ 3′方向
• 核酸 外切酶活性
– 5′→ 3′外切酶活性 – 3′→ 5′外切酶活性 • pol Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 – 大片段 （Klenow片段）：聚合活性、 3′→ 5′外 切活性 常用的工具酶
核酸外切酶活性
• Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA， DNA测序。
限制性核酸内切酶 (restriction enzyme)
• 识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸 二酯键 • 分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型 • 命名：
– EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ： 发现次序)
• 识别和切割位点
– 回文结构 4～6 bp
第八章 基因工程
• 基因工程 ( genetic engineering)、基因 克隆、DNA重组、 DNA克隆、分子克隆 • 克隆（clone） 无性繁殖
– 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分 子（复制子、重组体），继而通过转化或转 染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA 分子拷贝，或其表达产物。
• 1993 基因工程西红柿在美国上市 • 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 • 1999.9 中国获准加入人类基因组计划. 负责测定人类基因组全部序列的1% • 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作 草图 • 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 • 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程
碱性磷酸酶
切除末端磷酸基
一把特殊的剪刀 —限制性内切酶的发现
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯
(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖
• 1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、 B）的关系。 • 发现100-200个子代噬菌体中，只有1个 可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限 制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后 感染成功。 • 细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌 死亡。 • 原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。 • 假设：限制性内切酶与修饰酶。
– 出现两种末端 * 粘性末端 粘端 * 平头末端 平端 • 同工异源酶：来源不同，但能识别和切 割同一位点 • 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的 粘性末端
粘性末端与平头末端
EcoRⅠ GAATTC 3′ 3′ C TTAAG 5′
5′ 5′
粘性末端 G 3′ CTTAA AATTC 3′ G 5′
• 3′→5′外切酶活性 • 5′→3′外切酶活性
3′→5′外切酶活性 5′ 3 ′
末端脱氧核 苷酰转移酶 (TDT)
载体 vector
• DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和 表达 • 克隆载体、表达载体
– 原核载体：质粒(pBR322,pUC…） 噬菌体（λ，M13）等 – 真核载体：动物病毒载体pLXSN等