重组BCG疫苗的研究现状和进展

重组BCG疫苗的研究现状和进展
徐昊 2012301060018 生基一班
摘要：
卡介苗（bacille calmette-guerin，BCG）具有安全性高、热稳定性好等优势，以其为载体可构建重组卡介苗（recombinant bacille calmette-guerin，rBCG），rBCG 疫苗构建技术已被广泛应用于开发疫苗，以抵抗包括结核在内的各种感染性疾病。

本文主要对rBCG疫苗载体的发展、rBCG疫苗的免疫机制、以及在预防和治疗肿瘤、抵抗细菌、病毒及寄生虫感染方面的研究进展及其应用前景作一综述。

关键词：卡介苗 rBCG 疫苗
Abstract：
With advantages such as high safety and high thermostability，bacille Calmette-Guerin（BCG）may be used as a vector for construction of recombinant BCG（rBCG）. Recombinant BCG technology has been extensively applied in the development of vaccines against a variety of infectious diseases including tuberculosis（TB）. The paper reviews the prospect of rBCG vaccine in the development of Recombinant BCG vector、the immune mechanismand in the prevention and treatment of tumors as well as bacterial，viral and parasitic infections.
Key words：bacille calmette-guerin rBCG Vaccine
引言：
在现代医学中,疫苗作为预防疾病的一种手段,对消灭天花、控制脊髓灰质炎和阻断传染病的流行做出了重要贡献。

现有微生物疫苗种类包括死疫苗、减毒活疫苗、分子疫苗和DNA疫苗等,这些疫苗由于存在这样或那样的副作用,因此尚需研究新型微生物疫苗。

卡介苗(bacillus calmette-guerin,bCG)是一种活的减毒牛型大肠杆菌(mycobacterium bovis),主要用于结核病的防治。

分子生物学技术的发展为将BCG发展成为多价疫苗载体打下了坚实的基础。

为了将外源DNA有效引入分支杆菌,需构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体,即将分支杆菌的噬菌体(TM4或L5)或其质粒(pUC18、pUC19或pIJ666)与分支杆菌质粒(pAL5000)重组,同时引入一种编码抗生素或汞抗性的基因作为筛选标记。

这种穿梭表达载体含有分支杆菌复制起点(OriM)、大肠杆菌复制起点(OriE)、1个多克隆位点和1个筛选标记等,使重组DNA在大肠杆菌中操作,然后转化分支杆菌,通过自动复制或同源整合与基因组进行基因交换,从而在分支杆菌中稳定表达外源基因。

（1）正文：
1、重组BCG疫苗载体的发展
重组BCG疫苗的发展是随着载体的发展而得以推广的。

载体是重组BCG疫苗发展的关键因素。

概括的说,其经历了三个发展阶段。

1955年Rauzier等人从Myco-bacerium fortuitum中分离出质粒PALt5000,.并对其进行了测序,确定了质粒在分枝杆菌中复制的功能区oriM,为分枝杆菌染色体外表达外源基因奠定了理论基础。

由此产生了第一代大肠杆菌一分枝杆菌穿梭载体,如pYUB12,但因分子量过大(12kb),缺少可用的单一限制性酶切位点,所以不适于作为外源基因在分枝杆菌中表达的载体。

第二代大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体在此基础上有了较大的改进。

1991年,Stover等人利用点突变技术消除了分枝杆菌复制子中不必
要的限制性内切酶位点,并设计数对引物用多聚酶链反应(PCR)扩增出不同元件,共同组成了第二代大肠杆菌一分枝杆菌穿梭载体pMV261。

这些元件包括:E.coli 质粒复制子、分枝杆菌质粒复制子oriM、编码卡那霉素抗性的aph基因、分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的启动子及其下游的多克隆位点和转录终止子。

与此同时,他还构建于整合型载体pMv361。

即佣来百分枝杆菌噬菌体LS的粘附位点(attp)和整合基因(int)的DNA片段取代pMV261的oriM。

这样转化入BCG中的pMV361通过位点特异性重组,,整合到染色体的attB位点。

构建的第二代穿梭载体有以下优点:分子量小,在分枝杆菌中稳定;含有多克隆位点,具有容量大,便于外源基因的克隆和分离以及进二步分析等优点。

第二代穿梭载体的构建极大地促进了重组BC疫苗的发展,加速了它的推广与应用。

目前,已有数十种外源基因在分枝杆菌中得以表达。

随着人们对重组BCG疫苗研究的不断深入,第三代E.coli 卜分枝杆菌穿梭载体在近两年中开始孕育出来。

其主要特征为载体上带有指导外源基因在宿主细胞内定位表达和/或易于检测表达情况的特定序列。

D/Donnell 等人分别将表达的外源基因定位于宿主细胞膜上或胞浆中,并在表达鼠IL一2的氨基端带上流感病毒血凝素决定簇标志。

在中国,虽然对重组BCG疫苗的研究起步较晚,但目前已取得进展,先后构建了与国外水平相当的第一代和第二代E.coli分枝杆菌穿梭载体pBCG--8000和pBCG--2000,并将外源基因在分枝杆菌中得以表迭。

（2）
2、重组BCG疫苗的免疫机制
重组BCG疫苗诱导的免疫反应主要通过细胞介导免疫。

重组BCG疫苗经接种进人宿主体内,表达的重组蛋白由宿主细胞内活的微生物释放至胞浆中,经细胞浆内蛋白水解酶处理后,形成8一12个氨基酸级的多肽片段。

这些短肽含不同的抗原表位,与MHCI类分子结合形成抗原肤MHCI分子复合物,经高尔基体分布APC 表面,被T细胞受体(TCR)识别,激活CD8+细胞,诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应和Thl淋巴细胞产生LI一2和INF一r,而发挥抗微生物效应。

此外,重组BCG 疫苗也能诱导机体产生特异的体液免疫反应。

经APC提呈的多肽抗原片段,与
+ T MHCH型分子结合形成成熟的MHCII型抗原复合物,被转移至细胞后提呈给CD
4
细胞,Th2分泌IL一4、IL一5和IL10等,辅助激活B淋巴细胞转化浆细胞产生大量的抗体。

（3）
3、重组BCG疫苗的应用
以BCG为载体的重组疫苗研发日益受到国内外研究学者的关注和重视，针对的病原体涉及肿瘤、细菌、病毒、寄生虫等，重组卡介苗（recombinant bacille calmette-guerin，rBCG）具有广阔的发展前景。

3.1 重组抗肿瘤BCG 疫苗
随着分子生物学技术的不断发展，rBCG 疫苗的研究也取得了极大的进展，尤其是抗肿瘤rBCG疫苗。

研究证明，BCG 能够刺激机体免疫系统产生多种细胞因子，这与其抗癌效应密切相关。

在众多抗肿瘤BCG 疫苗中，抗膀胱癌BCG 疫苗的作用效果最为显著。

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其中表浅膀胱癌约占75%，该肿瘤单纯手术切除的近期复发率为60% ~ 70%，远期复发率几乎为100%。

自1976 年Morales 首次报道利用BCG 进行膀胱灌注治疗表浅膀胱肿瘤产生良好疗效以来，BCG 已被认为是治疗膀胱肿瘤的有效佐剂。

目前许多国内外学者利用多种细胞因子及某些抗原成功构建出抗膀胱癌的rBCG疫苗，部分疫苗正在开展临床试验研究工作，具有良好的发展前景。

虽然应用BCG 免疫疗法是目前阻止表浅膀胱癌的有效手段之一，但仍存在无应答和某些副作用，通过接种rBCG
疫苗有望进一步提高治疗效果。

研究表明，rBCG 疫苗能通过促进IFNγ、IL-2 等细胞因子高表达而增强T 细胞和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，达到抗肿瘤的效果。

BCG 在体外可直接激活外周血单个核细胞（peripheral blood mononucleated cell，PBMC）形成对肿瘤具有较强毒性作用的杀伤细胞。

除了抗膀胱肿瘤的rBCG疫苗外，在其他类别肿瘤疫苗研究方面也取得了一些进展，如乳腺癌、黑色素瘤等。

研究表明，黏蛋白-1（mucin-1，MUC1）是乳腺肿瘤相关性抗原，也是乳腺癌免疫疗法中一种非常有潜力的候选分子。

3.2 重组细菌BCG 疫苗
关于细菌方面的rBCG 疫苗，目前研究较多的是针对百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌和MTB的rBCG 疫苗。

到目前为止，BCG 仍是唯一用于预防结核病的疫苗，但现行的BCG仍存在一些不足亟待解决。

随着Ag85B、Ag85A、Ag85C 及ESAT-6 等一系列MTB保护性抗原陆续被发现，将这类抗原的编码基因在BCG中过度表达，从而制备rBCG 疫苗，有望提供比BCG更持久和有效的保护作用。

此外，研究发现HspX（MTB 产生的一类小分子热休克蛋白）在MTB感染短时间内可减缓MTB在体内的生长速度。

且有实验表明，过表达HspX的rBCG疫苗可增强BCG的保护作用。

国内外关于MTB 分泌蛋白rBCG 疫苗的报道，主要集中于以上几种蛋白，但多数结果表明，与BCG相比，已构建的rBCG疫苗的保护效果并未获得显著的提高
3. 3 重组病毒BCG 疫苗
麻疹病毒麻疹病毒感染仍然是婴儿死亡的一个主要原因,因而有必要在婴儿出生时母体中和抗体仍然存在的情况下给予麻疹疫苗接种。

为此,有研究者构建了能表达麻疹病毒核蛋白(nucel-oprotein)全长片段的rBCG(BCG一N),并用BCG-N免疫接种新生猴,随后用麻疹病毒攻击感染。

结果发现,免疫接种后即使在抗核蛋白抗体缺乏的情况下,仍能检测到核蛋白特异性淋巴细胞的增生应答。

尽管BCG书免疫接种并不能阻止全身性麻疹病毒感染,然而可明显改善攻击感染后的肺部炎症,且淋巴结中的病毒滴度也明显较低,一些免疫接种猴在攻击感染后鼻咽部病毒排泄物的分泌时间明显缩短。

这些结果表明,BCG一N免疫接种可诱发麻疹病毒特异的T细胞应答进而阻止病毒诱导的肺部病变。

人类或猴类免疫缺陷病毒(HIV或SIV)重组BCG疫苗早在1991年就有研究人员用hsp作为启动子构建可表达HIV一1gga、pol和env抗原的rBCG,用它来免疫小鼠可诱发体液和细胞免疫应答。

由于HIV的传播很可能是通过细胞介导的,因而有效的HIV疫苗应能诱发HIV特异的CTL。

研究表明,CTL应答对于控制HIV/sIV感染具有重要的作用,这些免疫应答可针对这两种病毒的许多成分,包括调节蛋白nef。

构建的rBCG可以表达nef,进而诱发针对HW/sIV的CTL应答。

用该BrCG免疫接种小鼠和豚鼠,结果发现免疫小鼠可诱导产生CTL,免疫豚鼠抗PND免疫血清滴度升高,并可中和HIV一MN。

过继转移免疫豚鼠的血清IgG可有效地阻止胸腺/肝移植的严重联合免疫缺陷(SCID)/hu或SCID/pBL小鼠的HIV感染。

而且,运用外周血单核细胞病毒中和法检测发现,免疫血清IgG可中和Hlv 的主要分离毒株。

这些资料进一步表明,分泌抗原的BrCG系统可用以研制HIV 疫苗。

3.4 重组寄生虫BCG 疫苗
硕大利什曼原虫病是一种由硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)引起的虫媒性疾病,可引起皮肤损害,称东方疖。

用减毒或灭活的L.major前鞭毛体或纯化的前鞭毛体表面蛋白酶GP63免疫人或动物均可产生较好的保护性免疫反应。

恶性疟原虫rBCG-CSP疫苗:恶性疟原虫(Plasmodium falci-parum)的环子孢子蛋白(circumsporozoite protein;CSP)均匀分布在恶性疟原虫子孢子表面,分子量为42～58KDa,有多个T和B细胞表位。

人们发现用X射线照射的按蚊叮咬或用X射线照射的子孢子接种人或动物均可产生保护力,这种保护力是由抗CSP的抗体和对CSP特异的CTL介导,抗CSP抗体或CSP特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)被动转移均可阻断子孢子侵入宿主肝细胞。

约氏疟原虫rBCG-MSP1疫苗:约氏疟原虫(P.yoelii)的裂殖子表面蛋白1(Merozoite surface protein 1;MSP1)是疟原虫红内期的一种主要抗原,其分子量为180～205KDa,可裂解为83,42和19KDa的小肽。

用重组MSP1免疫鼠可诱导抗P.yoelii的保护力,免疫猴也可诱导抗恶性疟原虫的保护力,抗MSP1的抗体可在体外抑制裂殖子侵入红细胞,抗体被动转移也可诱导保护力。

（4）
讨论：
重组BCG疫苗用于传染病的防治研究具有广阔的前景。

然而,作为一种新型的理想疫苗,尚有一些问题巫待解决。

如BCG生长缓慢和通过胆盐传代减毒的精确位点尚不十分清楚;分支杆菌细胞壁蜡质的存在及不通透性,不利于包括外源基因的分子运输;外源抗原在BCG中表述的最佳条件、重组BCG疫苗的免疫剂量及途径;BCG和大多数原核生物一样,其表达产物不能糖基化,不能对表达的抗原决定簇进行修饰;BCG易被胃酸杀死,使其活性易丧失,重组BCG作为口服疫苗还待发展等。

相信随着分子生物学、免疫学及遗传学技术的发展,可使BCG发展为一种有效的多菌苗载体,为人类传染病的防治发挥更大的作用。

参考文献：
1、李文桂《重组微生物-BCG疫苗及其运用前景》免疫学杂志Vol.18， No.3 ，June， 2002
2、程继忠皇甫永穆《重组BCG疫苗的研究进展》微生物学杂志Vol.16,No.4 ，1996
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5、王福祥《重组微生物BCG疫苗研究》Foreign Medical Sciences Epidemiology lemology February 2004 Vol.31 NO.1
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