抗体的选择2

如何选择二抗？
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择
，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因
此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后
继检测方案的要求，其中如何根据一抗的种属来
源和类型选择二抗尤为重要。
1、一抗的种属来源：
二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如
：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则 选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均 可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆 抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根
四甲基异硫氰酸罗丹明
• 在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜 作三标记的实验时， RRX 尤其有用，可以和Cy2 （ 或者FITC）和Cy5一起使用，因为RRX 的发射波长 在 Cy2 和Cy5 中间，而且和这两者覆盖都很少。氪 氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2
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（FITC）, RRX和Cy5的理想激发波长。
不能特异性的检测某种类型的IgG或者IgM。这时候就需要 针对特殊类型 Ig分子的二抗。如KPL的Anti-IgG （gamma ）二抗是由Anti-IgG（H+L）与IgM、IgA等吸附后的二抗 ，消除了能与后者结合的部分。
偶联到二抗上的探针种类
二抗
探针 酶
辣根过氧化酶 HRP 碱性磷酸酶AP 其衍生物 APAAP，PAP
三、免疫球蛋白的水解片段
1. 木瓜蛋白酶（Papain）（将重链于近氨基端切断） Fab段（fragment of antigen- binding，抗原结合片 段） Fab段可以与抗原结合，具有抗体的活性。
Fc段（fragment crystalizable，可结晶片段）
Fc段不能与抗原结合，但可执行Ig的其他生物 学功能。
7、Anti-IgG（H+L）、Anti-IgG （gamma）、 Anti-IgM （mu）、Anti-IgA （alpha）
• 在一些特殊的实验里，只需要检测样本里的IgG或者IgM， 常规的Anti-IgG （H+L）由于与IgG的重链和轻链都有结
合反应，而IgG、IgM、IgA 都有保守的轻链结构域，因此
•
由于在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继 检测方案的要求，因此除了需要考虑一抗的种属及类型外 ，还需要根据后继的检测方案选择不同标记的二抗，因此 需要对二抗的标记物进行选择。 按照标记分，有 HRP 、AP、生物素等标记二抗， FITC 、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等荧光二抗；按照 检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊 、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗； 另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2 等不同类型抗体。
抗体的选择
其木格 2010.10
主要内容
基础概念 如何选择二抗
标记物的选择 涉及的试验
概
念
1. 抗体（antibody, Ab）功能性概念
是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗 原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。 抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液 、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。
1.类和亚类（根据H链的抗原性不同） IgG —γ (gamma) IgA — α (alpha) (1)类 IgM — μ (mu) IgD — δ (delta) IgE — ε (epsilon)
(2)亚类
IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA：IgA1, IgA2
主要功能
荧光基团
FITC, RRX,
生物素
TR, PE,
Rhodamine
卵白素
常见二抗的应用
Western Blot
ELISA
细胞免疫化学 组织免疫化学 流式细胞术
Western Blot
组织免疫化学
•
HRP和AP是酶，二抗上挂了酶，要给相应的底物才能 显色，显色方式可以通过发荧光也可以不发荧光（例如给 予ECL底物，其中的H2O2和鲁米诺在HRP的作用下，能在黑 暗中发出荧光；也可以给予双氧水和 DAB ，反应产生棕色 不溶于水的物质）。 荧光标记物如FITC为异硫氰酸荧光素，本身就是黄绿 色荧光，二抗结合后可直接在荧光显微镜下观察；生物素 一般也是挂在二抗上的，利用卵白素分别连接生物素标记 的第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物 ，这个终产物也是不溶于水的。
5、是否经过血清吸附过的二抗
•
为减少二抗与样本的非特异性结合，需使用不 同血清吸附的二抗。如检测样本是人源的蛋白， 一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗 小鼠源的二抗，如果对实验的特异性要求很高， 推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种 二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（ 如IgG等）可能发生非特异性反应的IgG，因此将 非特异性结合降低到最低。
6、Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment
• 在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细 胞、B 细胞等细胞内，通常含有较多的 Fc 受体，这时候选 择二抗时最好选择Anti-IgG, F（ab’）2 fragment 这样 的特异性二抗，这样就消除了由于 Fc部分与 IgG的非特异 性结合。常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻 链都有结合反应，即与IgG 的 Fc的F（ ab’）2 片段都能结 合；由于 IgG 、 IgM 、 IgA 都有保守的轻链结构域，因此 Anti-IgG （H+L）与它们都有交叉反应。 • 而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc片段的 吸附，因此只与 IgG 的 F （ ab ’） 2 片段结合，然而 IgG 、 IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此与它们也有交叉反 应。
据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
1、一抗的种属来源：
常用的二抗产品包括： 抗小鼠二抗（anti-mouse）、抗兔二抗（anti-rabbit）、 抗山羊二抗（anti-goat）、抗绵羊二抗（anti- sheep）、 抗人二抗（anti-human）、抗豚鼠二抗（anti- guinea pig） 抗大鼠二抗（anti-rat）、抗猪二抗（anti-swine）、 抗马二抗（anti-horse）、抗牛二抗（anti- bovine）、
2、一抗的类别亚型：
在不清楚一抗为何种类/ 亚类的情况下，可以 选用抗相应物种IgG 。这类型的二抗有通用的 IgG （H+L）二抗，或者特异性只结合IgM 的Anti IgM （ mu ） Antibody 、 IgA 的 Anti IgA （ alpha ） Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon） Antibody等。
抗鸡二抗（anti- chicken）、抗鸭二抗（anti- duck）等。
2、一抗的类别亚型：
除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需 与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克 隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免 疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单 克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同
四甲基异硫氰酸罗丹明
• 四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate （TRITC）， Rhodamine Red-X（ RRX） , Texas Red（TR）荧光标记二抗
•
这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长
（550, 570, 596nm）和最大发射波长（570, 590, 620nm ）。尽管TRITC 经常和FITC 一起在双标记实验中使用，使 用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。
1. VL和VH是抗原结合的部位（FV区）。
2. CL和CH上具有同种异型的遗传标记。
3. IgG的CH2和IgM的CH3具有补体固有成分C1q的结合点，参 与激活补体系统。 4. CH3/CH4具有结合包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B细 胞、NK细胞等细胞的Fc段受体的功能。 5. IgG的CH2+CH3 具有介导IgG通过胎盘的特性。
4、二抗的耦联标记
• 一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶、荧光基团 、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体 的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶 标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免 疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗， 免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的 二 抗 。 如果 想 要更大 程 度的放 大 检测信 号 ，可以 使 用 Biotin/Avidin（生物素-亲和素）检测系统。在一些荧光 检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记 的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些
亚型进行选择。
2、一抗的类别亚型：
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明 书中都会有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相应 的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小 鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3） ，那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或 者您也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如 ，如果一抗是小鼠 IgG1，那么可以选择抗 IgG1 的 二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
2. 胃蛋白酶（Pepsin）（将重链于近羧基端切断）
F( ab ′)2 ：可结合2个抗原表位。 pFc ′：无生物学活性。
什么是一抗二抗？
一抗是针对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。 即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。 第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性 结合。 第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主 要用于检测抗体的存在。利用抗原-抗体反应原理， 就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接， 再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用 ，最后显色，发光位置就有目的蛋白。
•
3、二抗的种属来源
• 一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有 必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二 抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些
特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一
抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的
二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二
抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。驴来源的二 抗，非常适合做类似双标的免疫实验。
2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的 球蛋白。
抗体的分子结构
二、免疫球蛋白的功能区
功能区：是不连续，紧密折叠的区域，由重链和轻链 经链内二硫键连接而成的球状结构。该区具有特殊的 功能特性。
轻链：VL、CL 重链：VH CH1、CH2、CH3、CH4 IgG IgM IgA IgE IgD
四甲基异硫氰酸罗丹明 菁 类 染 料 藻红蛋白或藻胆色素蛋白 A C M A
异硫氰酸荧光素
• 异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate （FITC） 荧光标记二抗 • FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精 溶剂。 FITC 分子量为 389.4 ，最大吸收光波长为 490 ～ 495nm，最大发射光波长为 520 ～530nm，呈现明亮的黄绿 色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广 泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标 记几个 FITC 分子， IgM 通常用小分子的荧光素标记，如 FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人 眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红 色。然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一 起使用。
•
酶
• 主要有两种不同的酶耦联物，HRP和AP。比较 而言，前者更经济、快速、稳定，而后者较前者 更为灵敏，通常情况下，HRP广泛应用于免疫组化 、western blot和ELISA中，而碱性磷酸酶（AP） 更适合于固相的免疫检测实验，如ELISA和
western blot.
荧光基团
异硫氰酸荧光素