水杨酸对草莓炭疽病响应基因-em-FaNBS20-em-+表达的影响

园艺学报 2014，41（1）：53–62 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 水杨酸对草莓炭疽病响应基因FaNBS20表达的影响

张庆雨1,3，刘芳春3,4，段可3，王飞2,*，王延秀4，高清华3,*

（1西北农林科技大学林学院，陕西杨凌 712100；2西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100；3上海市农业科学院林木果树研究所，上海 201403；4甘肃农业大学农学院，兰州 730000）

摘 要：以栽培草莓（Fragaria × ananassa Duch.）‘久香’叶片为试材，采用同源克隆和RT-PCR方法，克隆FaNBS20全长cDNA序列，并利用实时荧光定量PCR技术检测外源SA处理协同草莓炭疽病病

原菌侵染对FaNBS20表达的影响。结果表明，FaNBS20的开放阅读框为3 573 bp，编码1 190个氨基酸，预测的蛋白质分子量为134.5861 kD，含有1个TIR结构域、1个NB-ARC结构域和1个亮氨酸的富集区，与森林草莓（Fragaria vesca subsp. vesca）抗烟草花叶病毒蛋白（XP_004292718）同源性高达99%。接种

草莓炭疽病菌对草莓抗炭疽病品种‘甜查理’FaNBS20的表达影响显著，易感病品种‘久香’FaNBS20

的表达则一直处于较低水平，表明该基因可能与对炭疽病的抗性相关。两个草莓品种在SA处理后对草莓

炭疽病的抗性均明显增强，且持续期可以达到10 d以上。在SA和草莓炭疽菌协同诱导下，FaNBS20基

因的表达量在抗性品种‘甜查理’和易感品种‘久香’中分别达到接种前的38倍和7.2倍。以上结果表

明，水杨酸能提高草莓对炭疽菌浸染的抗性，表达水平和炭疽病抗性水平相关的FaNBS20基因可能是水

杨酸参与的对炭疽病抗性响应途径中一个重要的成员。

关键词：草莓；水杨酸；胶孢炭疽菌；克隆；表达分析

中图分类号：S 668.4 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）01-0053-10 Effects of Salicylic Acid on the Expression of FaNBS20 Gene Responsive to Colletotrichum gloeosporioides Infection in Fragaria × ananassa

ZHANG Qing-yu1,2,3，LIU Fang-chun3，DUAN Ke3，WANG Fei2,*，WANG Yan-xiu4，and GAO Qing-hua3,*（1College of Forestry，Northwest A & F University，Yangling，Shanxi 712100，China；2College of Horticulture，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China；3Forestry and Fruit Tree Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China；4College of Agricultural Sciences，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730000，China）

Abstract：A full-length cDNA of FaNBS20 was isolated by homologous cloning and RT-PCR from Fragaria × ananassa Duch.‘Jiuxiang’. Sequence analysis indicated that FaNBS20 holds a 3 573 bp open reading frame encoding 1190 amino acids with an estimated molecular mass of 134.5861 kD. Bioinformatics analysis revealed that FaNBS20 contains typical domains of TIR，NB-ARC，and LRR type.

收稿日期：2013–07–16；修回日期：2013–12–11

基金项目：上海市科技兴农重点技攻关项目[（2012）第1–3号]；上海市科委现代农业领域重点科技攻关项目（12391901400）；农业部公益性行业（农业）科研专项（201003064-5）

* 通信作者Author for correspondence（E-mail：xnwangfei521@，qhgao20338@）

54 园艺学报41卷

FaNBS20 shares a 99% sequence similarity with the TMV resistance protein（GenBank accession No. NC_020492）from Fragaria vesca subsp. vesca. Expression of FaNBS20 was obviously changed by the inoculation of Colletotrichum gloeosporioides，a causal agent of strawberry anthracnose. Opposite changes were observed in two cultivars with different susceptibility to anthracnose. In both the resistant variety ‘Sweet Charlie’and the susceptible‘Jiuxiang’，resistance to C. gloeosporioides infection was clearly improved by spraying salicylic acid and this enhancement lasted for more than 10 d. Following the combined treatment of SA and C. gloeosporioides，expression of FaNBS20 showed a 38-fold and 7.2-fold increase in‘Sweet Charlie’and‘Jiuxiang’，respectively. These results indicate that the expression of FaNBS20 may be positively correlated to strawberry resistance，and external SA can increase strawberry resistance to anthracnose，probably，through a signaling network with FaNBS20 as an important component.

Key words：Fragaria × ananassa；salicylic acid；Colletotrichum gloeosporioides；cloning；expression analysis

由半知菌亚门炭疽菌属（Colletotrichum）3种炭疽菌引起的草莓炭疽病已成为草莓破坏性病害之一。充分挖掘抗病基因资源，利用分子标记辅助育种方法培育出抗病品种是防治炭疽病发生的最为经济且有效的途径。目前已从多种植物中克隆出许多抗病相关基因，其表达产物的氨基酸序列大多表现出高度保守性。NBS-LRR（Nucleotide binding site plus leucine-rich repeat）是成员最多、分布最广的抗病基因家族，大多数已鉴定的基因都包含1个核苷酸结合位点（NBS）和亮氨酸的富集区（LRRs）（Hulbert et al.，2001）。植物抗病基因的NBS区域被认为与传递信号有关（Tao et al.，2000）。NB-LRR蛋白功能涉及基础防御（Holt et al.，2005），在易感宿主上被致病病原体激活后，能限制病原体生长（Glazebrook，2005）。研究表明，NBS-LRR蛋白并不是仅仅由一些单独的功能单元构成，可能是由不同的共同进化的区域构成，如P-loop、亮氨酸重复，核苷酸结合基序及激酶结构域等；而且，信号感应和传导需要分子间的相互作用，进行病原菌的识别和信号转导。当植物细胞受到攻击时，植物激素也作为信号分子参与细胞的防卫反应（王友红等，2005）。

水杨酸（Salicylic acid，SA）在植物体内具有多重生理作用，一方面可作为内源信号分子参与植物对病原菌及其它逆境胁迫作出的应答并进行信号传递；同时又可作为激发子（外源信号分子）来诱导植物的抗病反应。前人的研究表明水杨酸与病原体防御有关，在双子叶植物和单子叶植物中，外源SA和它的功能类似物可激活病程相关基因的表达，并对病毒、细菌和病原真菌的侵害产生抗性。在烟草和拟南芥中则相反，通过细菌水杨酸羟化酶的表达量阻碍SA的积累，使SA转化成邻苯二酚，HR（高度敏感细胞死亡反应）减退，SAR（系统获得性免疫）消失。同样，突变或者使用SA合成相关酶的抑制剂，植物对病原体的易感性增强，而抗病性可以通过外源SA恢复（An & Mou，2011）。

本文报道了草莓FaNBS20的cDNA全长序列以及草莓炭疽病病原菌侵染后其表达的变化，通过定量RT-PCR技术分析了SA和炭疽菌（C. gloeosporioides）协同诱导对FaNBS20基因表达的影响，以探寻FaNBS20基因在草莓对炭疽病防御反应中的作用。本研究结果有助于从分子水平上揭示草莓应答炭疽病病原菌侵染所启动的基因防御响应，对于解析草莓NBS-LRR基因的功能及其表现炭疽病抗性的分子调控机理具有一定参考意义。此外，对于信号转导中关键基因变化的研究有助于进一步了解病害所诱导的防御信号途径。