脂多糖通过TLR4-Src信号介导微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白和增加血管通透性
肝素通过TLR4减少脂多糖刺激的人内皮细胞IL-8表达

肝素通过TLR4减少脂多糖刺激的人内皮细胞IL-8表达李旭;李鑫;马晓春【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(28)9【摘要】目的:观察肝素对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的人内皮细胞白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)水平的影响,并探讨Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR 4)在其中的可能影响。
方法:用LPS(10mg/L)刺激人肺微血管内皮细胞诱导损伤,肝素治疗组提前15 min分别加入100 U/L及103U/L普通肝素,正常对照组加入等量磷酸盐缓冲液。
分别在刺激2、6、12 h收集细胞上清,采用酶联免疫吸附法测定上清中IL-8的浓度。
在刺激2、6、12 h收集细胞提取RNA,应用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组细胞中IL-8、CD14及TLR4mRNA水平变化。
结果:与正常对照组比较,LPS刺激组IL-8 mRNA水平增高,6 h达到高峰,其蛋白水平于12 h达到高峰。
LPS刺激下TLR4 mRNA水平增高,6 h达到高峰,肝素降低其水平,差异有统计学意义(P<0.05)。
未检测到CD14 mRNA的表达。
结论:LPS刺激下人肺微血管内皮细胞IL-8表达增加。
肝素可能通过调节TLR4降低IL-8的水平,从而发挥保护作用。
【总页数】3页(P1699-1701)【关键词】脂多糖类;内皮细胞;肝素;受体,Toll样;白细胞介素8【作者】李旭;李鑫;马晓春【作者单位】中国医科大学附属第一医院重症医学科【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.肝素通过核转录因子-κB信号通路减少脂多糖刺激人内皮细胞趋化因子的表达[J], 李旭;马延全;陈恬璐;唐洁;马晓春2.肝素通过核转录因子-κB信号通路减少脂多糖刺激人内皮细胞趋化因子的表达[J], 李旭;马延全;陈恬璐;唐洁;马晓春;3.肝素通过Toll样受体4减少脂多糖刺激人内皮细胞粒细胞集落刺激因子的表达[J], 李旭;刘一娜;马晓春;4.肝素通过Toll样受体4减少脂多糖刺激人内皮细胞粒细胞集落刺激因子的表达[J], 李旭;刘一娜;马晓春5.高晶体-高胶体渗透压混合液对脂多糖刺激的人血管内皮细胞ICAM-1 mRNA表达的影响 [J], 袁世荧;张雪平;曾邦雄因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
脂多糖的作用机制与其在畜牧业的应用

脂多糖的作用机制与其在畜牧业的应用作者:刘波唐小懿周丽媛谢亮方热军来源:《湖南饲料》 2019年第2期摘要:脂多糖能够释放内源性活性因子,是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分,脂多糖发挥作用是通过机体细胞内一些列的信号转导作用。
在动物机体中注射脂多糖是模拟应激,研究其作用机制及营养干预的一种经典的方法。
本文综述了脂多糖的结构与功能,脂多糖诱导的TLR4信号通路及脂多糖在畜牧业的应用。
关键词:脂多糖;免疫应激;氧化应激1 脂多糖结构与生物学功能1 1脂多糖及其结构脂多糖f Lipopolysaccharides,LPS)又称内毒素,是大多数革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要成分,也存在于梳状菌数等少数革兰氏阳性细菌中.易被胃肠道吸收入循环系统.LPS的分子质量为2—20ku.能够提高细菌质膜负电性.增加质膜稳定性,保护质膜免受外界攻击.LPS主要由0-抗原、核心寡糖和脂质A组成.与磷脂类似有一亲水头和疏水头.核心寡糖在中间连接位于外层具有亲水结构的0-抗原和位于内层具有疏水性的类脂A.其中核心寡糖是由9—10个糖基组成的分枝寡糖链,又可被进一步划分为内核心寡糖与外核心寡糖.内核心寡糖通过酸不稳定的酮苷键将核心寡糖附着于脂质A.外核心寡糖主要由中性和碱性己糖组成,与0-抗原连接,其在不同菌株中存在单糖组成和构型上的差异,是决定LPS核心型的基础.脂质A是LPS生物活性中心和主要的毒性成分,是先天性免疫应答的有效刺激物.它由2个葡萄胺、磷酸盐和一定量的脂肪酸构成,高度保守,同一菌种的类脂A结构基本保持一致.0-抗原多决定LPS的抗原性.保护细菌免受抗生素的危害和抵抗补体系统的溶解作用,是由一定长度的寡糖单位首尾相连而行成的不同聚合度的聚合物,结构不稳定.根据脂多糖中是否含有0-抗原.可将脂多糖分为含有一定数量0-抗原的光滑型脂多糖fSmooth-LPS.S-LPS)和缺乏0-抗原仅由类脂A与核心寡糖组成的粗糙型脂多糖(Rough -LPS,R-LPS)。
小剂量脂多糖诱导血管内皮细胞TLR4的表达

小剂量脂多糖诱导血管内皮细胞TLR4的表达路玲;常文秀;曹书华;王勇强;高红梅【摘要】Objective To investigate the expression of Toll like receptor4(TLR4)on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) induced by small doses of lipopolysaccharide (LPS). Methods The ECV304 belonging to HUVEC was cultured in vitro, and hatched with LPS and LPS + antibody of TLR4(anti-TLR4) respectively. Cell proliferation activity was detected by MTT. The effect of LPS on change of the cell surface of TLR4 was observed with immunohistochemical staining method. The expression of TLR4-mRNA and of IL-8mRNA were evaluated by Fluorescence Detection Quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR). Results ECV304 cells stimulated by LPS of(10-50)ng/mL within 24 h, MTT detection showed no apparent change (P> 0.05); but with 100 ng/mL LPS stimulated the cells 24 h, the number of cells reduced significantly (P <T 0.05), under the circumstances, anti-TLR4 didn't withstand evidently. The 10 ng/mL LPS stimulated ECV304 in 24 h, the expression of TLR4 was elevatory; and with 50 ng/mL LPS stimulation, the expression of TLR4 was significantly increased in 6-24 h (P<0.05), with 50 ng/mL LPS stimulating ECV304 cells in 4 h and 8 h. The expression of TLR4-mRNA in LPS group and LPS+anti-TLR4 group increased significantly as compared with the normal control group (P<0.05), but LPS+anti-TLR4 group only in 8 h lower than LPS group;the expression of IL-8mRNA in LPS group and LPS+anti-TLR4 evaluated obviously as compared with the normal control group only in 8h, which did not affect with anti-TLR4. Conclusion Small doses of LPS can induce ECV304 cells expressing TLR4 and cause cell activation, and anti-TLR4 can inhibit TLR4 expression, but can't restrain cell activation.%目的:观察小剂量脂多糖(LPS)对人脐静脉内皮细胞(ECV304)TOLL样受体4(TLR4)表达的影响.方法:体外培养ECV304细胞,分别与LPS及LPS+TLR4抗体进行孵育.MTT法检测细胞的增殖活性,免疫组化染色法检测细胞表面TLR4的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞核核内TLR4-mRNA及IL-8mRNA的表达.结果:LPS(10~50 ng/mL)刺激ECV304细胞24 h内,细胞增殖活性无明显变化(P >0.05);而以100 ng/mL 刺激24 h后,细胞增殖活性明显降低(P< 0.05),TLR4抗体对此无明显拮抗作用.LPS能明显上调ECV304表达TLR4、TLR4-mRNA及IL-8mRNA,其中10 ng/mL的LPS在24 h时、50 ng/mL LPS在6~24 h时,TLR4表达具有统计学意义(P< 0.05);50 ng/mL的LPS刺激ECV304细胞在4 h及8 h 时,细胞核内TLR4mRNA 表达均明显升高(P < 0.05),而IL-8mRNA 表达在8 h 时明显升高(P < 0.05).TLR4 抗体对ECV304表达TLR4及TLR4-mRNA有拮抗作用(P< 0.05),对IL-8mRNA表达无明显拮抗作用(P> 0.05).结论:小剂量LPS可诱导ECV304细胞表达TLR4并引起细胞活化,TLR4抗体可抑制TLR4的表达,但不能抑制细胞的活化.【期刊名称】《中国中西医结合外科杂志》【年(卷),期】2012(018)001【总页数】5页(P47-51)【关键词】脂多糖;血管内皮细胞;TOLL样受体4【作者】路玲;常文秀;曹书华;王勇强;高红梅【作者单位】天津医科大学第一中心临床学院ICU,天津300192;天津医科大学第一中心临床学院ICU,天津300192;天津医科大学第一中心临床学院ICU,天津300192;天津医科大学第一中心临床学院ICU,天津300192;天津医科大学第一中心临床学院ICU,天津300192【正文语种】中文【中图分类】Q95-33脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要成分与毒力因子,可使内皮细胞活化,促使炎症介质、酶等释放,作用于凝血、纤溶系统,促发弥漫性血管内凝血。
活性氧作用于急性肺损伤

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脂多糖结合蛋白抑制肽对内毒素诱导的U937细胞TLR4的影响

脂多糖结合蛋白抑制肽对内毒素诱导的U937细胞TLR4的影响吴学玲;钱桂生;徐德斌;侯一峰【期刊名称】《中国急救医学》【年(卷),期】2005(025)001【摘要】目的研究脂多糖结合蛋白(LBP)抑制肽对内毒素(LPS)诱导的人单核巨噬细胞株U937细胞TLR4的影响.方法佛波脂(PMA)诱导U937成熟后分为5组,即正常对照组;LPS组;低剂量抑制肽组;中剂量抑制肽组;高剂量抑制肽组.用RT-PCR 和蛋白定量方法(Western blot)测定TLR4 mRNA和蛋白的表达,ELISA测定培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量.结果LBP抑制肽组TLR4的mRNA,蛋白的OD值,TNF-α的浓度均较LPS组低,较正常组高.结论LBP抑制肽通过抑制由TLR4介导的LPS信号跨膜转导和TNF-α的分泌,对LPS所致疾病如脓毒血症、急性肺损伤可能有潜在的治疗作用.【总页数】3页(P46-48)【作者】吴学玲;钱桂生;徐德斌;侯一峰【作者单位】第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所,重庆,400037;第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所,重庆,400037;第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所,重庆,400037;第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所,重庆,400037【正文语种】中文【中图分类】R378;R392.11【相关文献】1.硝普钠对内毒素诱导的U937细胞TLR4表达的影响 [J], 吴学玲;赵云峰;王兴盛;钱桂生2.脂多糖结合蛋白抗体对内毒素诱导的肺Ⅱ型细胞NF-κB活化的影响 [J], 李永旺;张德明;毛宝龄;钱桂生3.脂多糖结合蛋白对内毒素急性肺损伤大鼠肺巨噬细胞TLR4信号通路的影响 [J], 张德明;李永旺;毛宝龄;钱桂生4.CD14抑制肽对内毒素诱导U937细胞表达TNF-α的影响 [J], 冯起甲;徐智;吴国明;刘红艳;胡川闽;徐顺贵;钱桂生5.脂多糖结合蛋白抑制肽对内毒素诱导的人单核巨噬细胞株表达CD14的影响 [J], 吴学玲;钱桂生;徐德斌;侯一峰因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
脂多糖对小胶质细胞血管内皮生长因子表达的影响

脂多糖对小胶质细胞血管内皮生长因子表达的影响曾勇;吕靖芳;郁龚杰;高伟伟;张建宁【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2016(044)006【摘要】目的:探讨脂多糖(LPS)是否能够通过低氧诱导因子-1α(HIF-1α)调节小胶质细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达。
方法培养BV2小胶质细胞系,分为4组:对照组、LPS(100µg/L)刺激组、LRS干预组(LPS 100µg/L及脂多糖拮抗剂200µg/L),HIF-1α抑制剂干预组(LPS 100µg/L及FM19G1110 mmol/L)。
分别采用免疫荧光、West⁃ern blot、ELISA检测VEGF和HIF-1α的表达情况。
结果与对照组比较,LPS可显著增加BV2细胞VEGF表达,脂多糖拮抗剂可明显抑制LPS的这一作用。
HIF-1α的表达在LPS刺激8 h后明显增加。
HIF-1α抑制剂FM19G11可减少LPS引起的BV2细胞VEGF表达增加。
结论LPS促进小胶质细胞VEGF的表达,HIF-1α参与这一调节过程。
%Objective To investigate whether lipopolysaccharide (LPS) can induce vascular endothelial cell growth factor (VEGF) expression in microglia regulated by hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α). Methods The cultured BV2 cells were divided into four groups:control group, LPS (100 µg/L) simulated group, LPS (100 µg/L)+LPS antagonist (LRS, 200 µg/L) intervened group and LPS (100 µg/L)+HIF-1αinhibitors FM19G11 (10 mmol/L) intervened group. Immunofluorescence staining, Western blotting and ELISA were used to detect the expressions of VEGF and HIF-1α. Results Compared with the control group, the VEGF expression level was obvious high in LPSsimulated group (P<0.05). LRS inhibited this effect of LPS (P<0.05). The HIF-1αlevel was increased in LPS simulated group at 8 h post-injury(P<0.05). FM19G11, the inhibitor of HIF-1αreduced the expression of VEGF induced by LPS (P<0.05). Conclusion LPS can up-regulate the expression of VEGF by HIF-1α.【总页数】4页(P669-671,648)【作者】曾勇;吕靖芳;郁龚杰;高伟伟;张建宁【作者单位】天津医科大学总医院神经外科,天津市神经病学研究所邮编300052;天津医科大学总医院神经外科,天津市神经病学研究所邮编300052;天津医科大学总医院神经外科,天津市神经病学研究所邮编300052;天津医科大学总医院神经外科,天津市神经病学研究所邮编300052;天津医科大学总医院神经外科,天津市神经病学研究所邮编300052【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.丙泊酚对脂多糖诱导的小胶质细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响 [J], 冯社军;王慧娟;武艳强;李军涛2.美满霉素对脂多糖诱导的BV-2小胶质细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响 [J], 王岚;沈伟3.甘草黄酮对脂多糖诱导小胶质细胞iNOS表达\r和NF-кB活化影响 [J], 陈浩;张皓洁;师亮;李滢昊;任衍康;景玮;王燕宏;李新毅4.Rg1和GR阻断剂对脂多糖诱导的BV2小胶质细胞iNOS及COX2蛋白表达影响 [J], 任晓璠;孙宪昌;王宇鑫;闫伟宁;马灵志;陈文芳5.雌激素膜受体激动剂G1对脂多糖诱导小胶质细胞iNOS表达影响 [J], 高先琦;孙宪昌;姜明春;陈筱涵;王雅迪;陈文芳因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
幽门螺杆菌脂多糖可作为TLR4拮抗物

幽门螺杆菌脂多糖可作为TLR4拮抗物
朱月明(摘);章崇杰(校)
【期刊名称】《国外医学:微生物学分册》
【年(卷),期】2005(28)5
【摘要】幽门螺杆菌(Hp)是一个呈螺旋状、微需氧、有鞭毛的革兰阴性细菌,它能够寄居在胃上皮细胞以及胃黏膜上。
在发展中国家,人口中70%~90%都携带有Hp,虽然大部分被感染者表面上没有症状,但是Hp感染可导致B型慢性胃炎、消化性胃溃疡和黏膜相关的淋巴组织淋巴瘤。
【总页数】2页(P46-47)
【关键词】幽门螺杆菌(Hp);TLR4;拮抗物;脂多糖;淋巴组织淋巴瘤;胃上皮细胞;革兰阴性细菌;B型慢性胃炎;消化性胃溃疡
【作者】朱月明(摘);章崇杰(校)
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】R573.1;R575
【相关文献】
1.TLR4受体抑制剂对脂多糖促进人黑色素瘤A375细胞增殖和迁移的影响 [J], 郑增光;王鹏雁
2.PPAR-γ激动剂干预TLR4/PI3K通路对脂多糖诱导人冠状动脉血管内皮细胞Cx43表达的影响 [J], 吴立晗;巫相宏;闭奇;文伟明
3.TLR4-IN-C34通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路减轻脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应 [J], 张姗姗;刘漫;刘冬妮;杨滢霖;王月华;杜冠华
4.miR-519d-3p通过调控TLR4/NF-κB通路促进脂多糖诱导的肺上皮细胞凋亡[J], 周垂杨;柯乐斌;高仁贤
5.miR-519d-3p调控TLR4抑制脂多糖所致THP-1源性巨噬细胞炎症的机制研究[J], 周垂杨;柯乐斌;高仁贤
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小檗碱对脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞炎症反应的影响

小檗碱对脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞炎症反应的影响张奇瑜;邓轲;杨菁;刘桦;尹小菲【期刊名称】《广西医学》【年(卷),期】2018(040)022【摘要】目的探讨小檗碱对脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)炎症反应的影响.方法应用不同浓度(250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125、0.9765μmol/L)的小檗碱干预HUVECs后,采用四甲基偶氮唑盐法检测HUVECs的增殖情况.将HUVECs分为空白组、脂多糖组、脂多糖+1.25μmol/L小檗碱组、脂多糖+2.50μmol/L小檗碱组、脂多糖+5.00μmol/L 小檗碱组.空白组加入等体积磷酸缓冲液,其余4组加入相应药物干预,其中脂多糖的干预浓度为0.05μg/ml.比较5组白细胞介素(IL)-6水平及Toll样受体4(TLR4)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-11、Caspase-1、NOD样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、IL-1β蛋白表达水平.结果不同浓度小檗碱对HUVECs增殖均具有抑制作用,半抑制浓度接近5.00μmol/L.脂多糖组、脂多糖+5.00μmol/L小檗碱组、空白组IL-6水平依次降低(P<0.01).除脂多糖+1.25μmol/L小檗碱组中NLRP3-ASC外,其余脂多糖+不同浓度小檗碱组TLR4、Caspase-11、Caspase-1、NLRP3、ASC、HMGB1和IL-1β的表达水平均较脂多糖组降低(均P<0.05).结论小檗碱可能通过抑制Caspase-11介导的非经典的NLRP3炎症小体通路来减轻脂多糖诱导的HUVECs炎症反应.【总页数】5页(P2706-2709,2720)【作者】张奇瑜;邓轲;杨菁;刘桦;尹小菲【作者单位】成都医学院生物科学与技术学院,四川省成都市 610500;四川省德阳市公安局技术科,德阳市 618014;成都医学院生物科学与技术学院,四川省成都市610500;成都医学院生物科学与技术学院,四川省成都市 610500;成都医学院生物科学与技术学院,四川省成都市 610500【正文语种】中文【中图分类】R34【相关文献】1.活化蛋白C对脂多糖诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响研究 [J], 陈平;章永平;乔敏敏;袁耀宗2.盐酸小檗碱对脂多糖诱导的大鼠急性脑损伤后脑组织形态学和NF-κB活性的影响 [J], 马竞; 何文龙; 高重阳; 余瑞云; 薛鹏; 牛永超3.二妙散主要成分盐酸小檗碱与白术内酯Ⅲ对脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎性活化的影响 [J], 易慧敏;陆韵薇;许孟秋;于顾然4.miR-30a对脂多糖诱导人脐静脉血管内皮细胞自噬的影响 [J], 王丽君;赵瑜;胡烨;郭君平;张炜5.重组牛脂多糖结合蛋白对脂多糖诱导的奶牛乳腺炎症反应指标的影响 [J], 厉成敏;朱乐乐;李莲;王根林因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
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脂多糖通过TLR4-Src信号介导微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白和增加血管通透性∗张晔;张连阳;谭浩;李阳;孙士锦【摘要】目的::探讨脂多糖(LPS)诱导微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白(VE-Cad)的可能机制。
方法:培养人血管内皮细胞株CRL-2922,当其生长至融合状态时分为正常对照组(不予再处理)、LPS处理组(采用10μg/ml LPS分别与CRL-2922再培养1h、2h、4h和6h)、LPS+抑制剂组包括Toll样受体4(TLR4)抑制剂 CLI-095和Src 抑制剂SU6566[在 LPS培养细胞时分别加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)再培养4h]。
采用 Western Blotting法检测各组 Src蛋白表达、Cav1磷酸化和 VE-Cad质膜蛋白表达,以及Cav1与 VE-Cad共沉淀水平;采用培养小室半透膜培养细胞,并检测相关各组细胞荧光透过率,以反映血管通透性。
结果:LPS处理不同时间组 Src 蛋白表达均较正常对照组升高(P<0.05);与正常对照组比较,LPS处理4h组Cav1磷酸化增强(P<0.05)、VE-Cad质膜蛋白表达下调、Cav1与 VE-Cad共沉淀水平升高(P<0.05),单层细胞荧光透光率增加(P<0.05);TLR4抑制剂和Src抑制剂可显著降低 LPS增高的 Src蛋白高表达和Cav1高度磷酸化(P<0.05),上调 VE-Cad质膜蛋白表达(P<0.05),下调Cav1与 VE-Cad共沉淀水平(P<0.05),改善单层内皮细胞通透性(P<0.05)。
结论:LPS可能通过TLR4-Src 信号途径诱导微囊胞吞 VE-Cad和增加血管通透性。
%Objective:To observe the mechanism of caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad after LPS treat-ment.Method:Human vascular endothelial cell line CRL-2922 was cultured.It was divided into normal control group (when it grew to confluence state),LPS-treated group (using 10μg/ml LPS to incubate with the CRL-2922 for 1h,2h,4h and 6h);and LPS+inhibitor group[adding CLI-095 (5μg/ml)and SU6566 (2μmol/L)in the LPS cultured cells and then culturing for 4h].Western Blotting was used to detect the Src protein expression,Cav1 phosphorylation,plasma membrane protein expression of VE-Cad,phosphorylation of Cav1 and co-precipitation lev-els of Cav1 and VE-Cad;semi-permeable membrane was used to culture cells,and the relevant cells fluorescence transmittance was detected to reflect vascular permeability.Results:The protein expression of Src was gradually in-creased after LPS treatment,as well as the phosphorylation (Tyr14)of Cav1 and he monolayer cell permeability (P<0.05),and the membrane expression of VE-Cad decreased (P<0.05).The increased expression and phosphorylation could be decreased by the inhibitor of TLR4 CLI-095 and the inhibitor of Src SU6656 (P<0.05),and the inhibitors could increase the membrane expression of VE-Cad (P<0.05),and improve the monolayer cell permeability at 4h after LPS treatment (P<0.05).Conclusion:Caveolae-mediated endocytosis of VE-Cad was activated through LPS-TLR4-Src signal pathway.【期刊名称】《微循环学杂志》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】4页(P1-4)【关键词】脂多糖;Toll样受体4;Src蛋白;微囊胞吞血管内皮钙黏蛋白;血管通透性【作者】张晔;张连阳;谭浩;李阳;孙士锦【作者单位】第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042;第三军医大学大坪医院野战外科研究所创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042【正文语种】中文【中图分类】R605.971严重创伤、脓毒症患者存在血管通透性增高,脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是脓毒症的重要启动因子,阐明LPS诱导血管通透性增高的发生机制有重要意义。
本实验室前期研究(待发表)发现,细胞质膜微囊(Caveolae,简称微囊)介导血管内皮钙黏蛋白(Vascular Endothelial Cadherin,VE-Cad)胞吞是LPS致血管通透性增高的重要原因;同时发现,微囊胞吞VE-Cad过程中,微囊重要结构蛋白小窝蛋白(Caveolin-1,Cav1)磷酸化显著增高。
但LPS磷酸化Cav1的信号途径目前尚不清楚。
研究表明,人肺微血管内皮细胞原癌基因c-Src活化可加强Cav1磷酸化和微囊胞吞白蛋白和霍乱毒素B亚基 [1],而LPS可活化Src[2],且与Toll样受体4(Toll-like Receptor 4,TLR4)有关[3]。
因此推测,LPS可能通过TLR4和Src途径磷酸化Cav1,进而调节微囊胞吞行为,增加内皮细胞和血管通透性。
本实验采用LPS 处理人血管内皮细胞株CRL-2922,通过免疫印迹法检测其Src蛋白表达、Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达,以及Cav1与VE-Cad共沉淀水平,同时采用生物半透膜检测单层内皮细胞的荧光透过率,探讨TLR4-Src途径是否参与LPS诱导微囊胞吞VE-Cad和增加血管通透性。
1.1 实验用细胞、试剂和仪器人血管内皮细胞株CRL-2922购自ATCC (American Type Culture Collection)。
VE-Cad抗体(批号:sc-6458)、Cav1抗体(批号:sc-894)和c-Src抗体(批号:sc-18)均购自美国Santa Cruz公司;Cav1 Tyr14位点磷酸化抗体(批号3251)购自美国Cell Signaling公司,异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白(FITC-BSA)、LPS(批号L2880)和β-actin(批号A5441)均购自美国Sigma公司;质膜蛋白提取试剂盒(批号:ab65400)购自美国Abcam公司;Src抑制剂SU6656(批号:572636)购自美国Merck公司,TLR4抑制剂CLI-095(批号:243984-11-4)购自美国Invivogen公司;DMEM-高糖培养基购自美国HyClone公司,胎牛血清购自美国Gibco公司。
培养小室(型号3452)购自美国Corning公司,1.2 实验方法1.2.1 细胞培养及分组处理:将CRL-2922细胞株加入含15%胎牛血清、4mmol/L L-谷氨酰胺、4 500mg/L葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中,分别用25ml培养瓶和培养小室半透膜培养。
当细胞生长至融合状态时,随机分为正常对照组、LPS处理组(包括1h、2h、4h、6h亚组)和LPS+抑制剂组(包括TLR4抑制剂CLI-095和Src抑制剂SU6566),各组n均=4。
正常对照组不予再处理;LPS处理组采用LPS(10μg/ml)与培养细胞再培养不同时间;LPS+抑制剂组即在LPS培养细胞时分别加入CLI-095(5μg/ml)和SU6566(2μmol/L)共同培养4h。
收集各组细胞,按常规方法提取细胞总蛋白,采用Western Blotting检测各组Src蛋白表达、Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达,以及Cav1与VE-Cad共沉淀水平,同时检测各组内皮细胞荧光透过率(血管通透性)。
1.2.2 Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad质膜表达以及Cav1与VE-Cad共沉淀水平检测:(1)Src蛋白、Cav1磷酸化和VE-Cad质膜表达的检测:均参照常规Western Blotting,采用8% SDS-PAGE凝胶电泳,Src抗体滴度1∶1 000,Cav1磷酸化抗体滴度1∶1 000,VE-Cad抗体滴度1∶200,β-actin抗体滴度均为1∶2 000。
Quantity One软件分析蛋白电泳条带,以Src蛋白、Cav1磷酸化、VE-Cad与β-actin光密度比值分别表示上述蛋白表达水平。
(2)Cav1和VE-Cad免疫共沉淀:在细胞裂解液中分别加入VE-Cad抗体(1∶50)和蛋白G-琼脂糖,4℃过夜,洗涤沉淀并煮沸分离后,常规Western Blotting检测Cav1(1∶200稀释)表达,洗膜后检测VE-Cad质膜表达。