细胞系与细胞克隆

4、琼脂克隆法
用于病毒转化细胞、恶性转化细胞
1）琼脂培养液的制备（Difco）
2%琼脂母液--45℃水浴（琼脂母液和完全培 养液）混合成0.33%琼脂培养液加入试管内 2.5ml-- 45℃水浴
2）消化、稀释、接种和培养待克隆细胞
每管内加入0.5ml细胞悬液—凝固（4 ℃）–培养
琼 脂 克 隆 法 图 解
第八章
细胞系与细胞克隆
1、细胞系（cell line）：原代培养物经首 次传代后即成。
2、有限细胞系（finite cell line）：不能 继续传代或传代数有限。
3、连续细胞系（continuous cell line）即 连续传代的细胞系。
4、细胞株（cell strain）通过选择法和克 隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的 具有特殊性质和标志的培养物。
一、传代培养（passage）
• 概念：无论是否稀释，将细胞从一个培养 瓶转移或移植到另一个培养瓶。
（一）传代培养的方法 1、从生长器皿上解离细胞的方法：从1-8依次加
深。
2、单层培养细胞的一般传代步骤: 倒出旧液-PBS洗涤-胰蛋白酶消化-吸出消化液-加 入培养液吹散细胞-计数-稀释-培养
3、悬浮细胞的传代培养
二、细胞系的建立
正常细胞系建立的程序包括：原代培养、第 一次传代、常规传代和冻存、复苏等阶段。
源自文库
细胞系的维持
1、细胞系档案要记录好：组织来源、培养基要求、传 代时间等； 2、传代换液有规律，否则会引起生物学特性改变； 3、多种细胞维持传代，要防止交叉污染； 4、要有充足的冻存储备，防止因污染造成绝种；另外， 细胞暂时不用，最好冻存，以免老化或性状改变。
5、在琼脂基底上用甲基纤维素克隆化
2%琼脂母液--45℃水浴（琼脂母液和2倍浓度 培养液）--1：1混合-- 45℃水浴—铺板—细胞悬 液内加等体积的1.5%甲基纤维素混合后铺于琼脂 层上培养
在 琼 脂 基 底 上 用 甲 基 纤 维 素 克 隆 化 图 解
（二）影响克隆形成率的因素
克隆形成率 (cloning efficiency)是指向底 物接种单细胞悬液能形成细胞小群的百分数
1.稀释铺板法：最常用
消化—低密度细胞悬液制备—接种—标记与培 养—分离扩大培养—观察—移植瓶或皿内培养
注意事项：
1）确保一个细胞，注意培养孔的周边 2）轮廓清晰完整，体积适宜的健康细胞 3）不需换液
2、饲养层克隆法
• 饲养细胞（feeder cell）：也称滋养细胞，是一层 经过射线或丝裂霉素C处理过的供其它细胞附着 的细胞层，如成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。
• 注意：3周内饲养细胞即死亡，要及时应用。
饲 养 层 克 隆 图 解
3、胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法：
1）胶原膜板或血纤维蛋白膜板的制备 2）消化、稀释、接种和培养待克隆细胞
血纤维蛋白膜板制备
A液：0.2μg凝血酶,100ml培养液 B液:250mg 牛血纤维蛋白原、800mg NaCl、 25mg 柠檬酸钠、1000毫升双蒸水 A：B=4：1
三 、细胞克隆
• 细胞克隆（clone）是指单个细胞通过有丝分裂形 成的细胞群体，他们的遗传特性相同。
• 细胞克隆化培养（cell cloning culture）：又称单 个细胞分离培养，是指将单个细胞在一定支持物 上增殖培养而产生细胞群落的过程。
（一）克隆培养技术
分类（生长基质或培养物） 稀释铺板法、饲养层克隆法、胶原膜板或血纤维蛋 白膜层板克隆法、琼脂克隆法等。
2、射线照射分离克隆法
将培养瓶倒置放于X射线或钴60源下，用 2mm厚的铅片盖住选中的克隆。
3、悬浮细胞克隆分离
24孔板加入1ml培养液—用毛细吸管吸取群落— 吹入培养板内
作业
1、概念：细胞系，细胞株，传代培养，细胞克隆， 克隆形成率
2、常见的克隆培养技术有哪几种，简要叙述其技 术要点
3、影响克隆形成率的因素 4、克隆分离的方法和技术要点
离心法：离心后去上清，加培养液，吹打，传代。
直接传代法：将细胞慢慢沉淀，将上清吸去1/2-2/3， 加培养基，传代。
(二) 传代培养的注意事项
1、传代时机与传代培养的细胞密度：细胞没 生长到足以覆盖的瓶底壁的大部分表面前， 不要急于传代。
2、传代数或代数：指对培养物传代的次数。 3、尽量少传代，避免转化。
影响因素：
– 1、细胞密度。10个/ml – 2、培养液。HamF12k – 3、血清 – 4、饲养细胞 – 5、激素和生长因子：胰岛素，地塞米松，EGF，
BFGF。 – 6、CO2 – 7、适应性生长基质：胶原层，血浆纤维蛋白层，多聚
右旋赖氨酸，纤维连接蛋白，琼脂
（三）克隆的分离
1、克隆化环分离法