第8章 细胞重组与克隆技术

第8章细胞重组与克隆技术

8.1细胞重组

8.1.1细胞重组定义

指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。

8.1.2细胞重组的特点与意义

8.1.3细胞重组方式

细胞重组的方式基本分为以下三种：

（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。

（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。

（3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。

8.1.4细胞重组材料的获得

8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得

定义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。

制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。

制取容器及条件

结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。

8.1.4.2 核体的获得

定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。

制备方法：

8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得

定义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。

制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。

将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。

8.1.5 显微操作技术

借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。

8.2克隆技术

植物界——吊兰

动物界——孙悟空

8.2.1 克隆(clone)的定义

本意——是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前——指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术——核移植。

克隆的三个层面

分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。

细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。

动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础

细胞全能性。

细胞的分化。

植物界

*克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。

*试管植物。

*花药培养。

*基因克隆—植物基因工程的核心

动物界

*与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。

*尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认识，人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。

克隆技术的里程碑

*首只体细胞克隆动物“多莉”(Dolly)羊的成功证明了成熟的体细胞也具有全能性。

8.2.3 哺乳动物克隆的技术方法

*胚胎分割

*胚胎嵌合

*胚胎干细胞核移植

*胚胎细胞核移植

*胎儿成纤维细胞核移植

*体细胞核移植

分析

胚胎分割和胚胎嵌合不属于真正意义上的克隆，严格说属于胚胎工程的范畴。

其它方法都是涉及细胞核移植，只是细胞核来源不同而已。

8.2.4 细胞核移植技术

（一）定义

是利用显微操作仪，将一个细胞（核供体细胞）的细胞核移入另一个去核细胞（核受体细胞）中，经人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。即胞质体与核体的重组。

是目前最常用动物克隆技术，是哺乳动物体细胞克隆的核心技术

8.2.4 细胞核移植技术

核供体细胞：胚胎细胞、胚胎干细胞、胎儿成纤维细胞、体细胞。

（其中以胚胎细胞克隆最为普遍，而以体细胞的克隆意义最大）

核受体细胞：去核的卵母细胞、受精卵、2-细胞胚胎

8.2.4 细胞核移植技术

（二）发展历史

1938年，德国胚胎学家汉斯.施佩曼（Hans Spemann）博士，最早提出核移植的构想。没有实现

1952年，美国人罗伯特.布里格斯（Robert.Briggs)和T.J.金，利用两栖类卵细胞建立了细胞移植技术

8.2.4 细胞核移植技术

（三）核移植技术操作过程

*核受体细胞的准备

*核供体细胞的准备

*细胞核移植

*激活

*重组胚的体内或体外培养

*胚胎移植

核受体细胞的准备

✧去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。因为在卵母细胞的细胞质中含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化的细胞重新回到原点，同受精卵一样开始个体发育过程。

✧卵母细胞的来源

一是，用激素进行超排处理再从输卵管冲出成熟的 MII卵母细胞。

二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘-卵母细胞复合体，在体外培养成熟后作为受体。

✧核受体细胞的去核