细胞工程细胞拆合与克隆技术

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细胞分离与克隆技术在蔬菜品种改良中的应用

细胞分离与克隆技术在蔬菜品种改良中的应用细胞分离与克隆技术是一项重要的生物技术，它在蔬菜品种改良中发挥着重要的作用。

蔬菜是人们日常生活中重要的食物来源，种类繁多，每一种蔬菜都有其独特的特点和特定的需求。

在传统的育种方法中，蔬菜品种的改良是一项耗时且复杂的任务，而细胞分离与克隆技术的出现使得这一过程更加高效并且具有潜力。

细胞分离与克隆技术是指用细胞分离、培养和克隆手段获取个体化的细胞，通过人为干预的方式，再将这些细胞培养和繁殖成为整个植株，从而达到蔬菜品种改良的目的。

这项技术的应用主要集中在下面几个方面：首先，细胞分离与克隆技术可以通过组织培养的方法产生体细胞突变的个体。

在培养过程中，细胞会不断分化和增殖，而某些细胞可能会发生突变，产生新的性状。

这些突变体具有潜在的改良价值，并且可以通过有选择地进行培养和繁殖，获得新的蔬菜品种。

这种方法比传统的自然突变筛选更加高效，并且可以大大缩短改良周期。

其次，细胞分离与克隆技术还可以应用于蔬菜的转基因改良。

转基因技术是指通过人为将外源基因导入植物细胞中，从而赋予植物新的性状和特征。

蔬菜的转基因改良可使其获得抗病虫害、提高产量和改善质量等特点。

通过细胞分离与克隆技术，可以选择性地获取要转基因的细胞，将其转入希望改良的蔬菜品种中，从而实现特定性状的引入。

这种方法可以大大缩短转基因过程中的时间和成本，并且有助于提高转基因植物的转化率和稳定性。

此外，细胞分离与克隆技术还可以用于蔬菜的质量繁殖。

在一些优质的蔬菜品种中，存在着某些优质的性状，如营养价值、口感和色泽等特点。

通过细胞分离与克隆技术，可以选择性地获取这些优质性状的细胞，并通过体细胞培养的方式扩繁和繁殖。

这样可以保持优质种质的纯度，并且无论何时可以通过这些优质细胞恢复该品种，确保蔬菜品质的稳定。

最后，细胞分离与克隆技术还可以用于蔬菜的组织培养和组织工程。

通过取出蔬菜体内的小儿球体、中心、生长点等组织，使用适当的培养基和生长条件进行培养，可以获得大量的幼苗或原生质体，再通过人为植株的繁殖，可以迅速获得大量的育苗。

8细胞工程第八章

8.2.2克隆的相关理论基础
细胞的全能性与细胞机能特化两者之间是相互矛盾的。单细胞微生物具有全能性，而高等生物细胞有了机能特化趋势
植物细胞具有全能性而动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的个体，因为分化细胞的基本组发生了不可逆的修饰。 Spemann提出了“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。
8.2.2克隆的相关理论基础
8.2.3克隆的技术方法
8.2.4克隆技术的应用与意义
8.2.5正确看待克隆技术
8.2.6克隆动物的现状和发展趋势
8.2.1克隆的定义
克隆（clone)一词源于希腊语clonos，原意指用于扦插的枝条twig，也就是无性繁殖本意指遗传上完全相同的分子，细胞或来自于同一祖先的生物个体的无性繁殖群体外延的含义：1、核移植操作可以得到重组细胞，重组细胞可以繁殖成一个无性系；2、基因工程可将特定基因拼接到质粒的复制子上随复制子的复制，也能得到DNA的无性系本章专指核移植技术得到无性系动物
第八章细胞重组与克隆技术
8.1细胞重组 8.2克隆技术
8.1细胞重组
细胞重组（又叫细胞拆合）是指从活
细胞中分离出细胞器及其组分，然后体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术
8.1.1特点和意义
8.1.2细胞重组技术
8.1.1特点和意义
Prim Singh
Dolly标本与Ian Wilmut
鱼核移植
2.7kg/5months and 7.4kg/17months
快速生长的鲤鲫核鱼
据俄罗斯新闻网2005年10月29日报道，意大利克雷莫纳繁殖技术研究中心克隆技术专家组组长切萨雷· 加利教授介绍说，该中心还是首次一次性成功地克隆出如此多的哺乳类动物。目前，小猪仔们的健康状况良好。加利教授认为，克隆猪技术的成果对医学界非常有研究价值，它有助于医学工作者们进一步探索将动物内脏移植到人体的可能性。

干细胞工程克隆技术知识点

《干细胞工程》知识点过关班级姓名
1、干细胞：具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞称为干细胞。

2、干细胞的分类：按照分化程度从小到大
（1）全能干细胞，例：受精卵（胚胎干细胞），能发育成一个完整的个体。

（2）多能干细胞，例：造血干细胞，能分化成多种组织。

（3）专能干细胞，例：神经干细胞，能分化成各种神经细胞。

3、胚胎干细胞：
（1）来源于早期胚胎或原始性腺
（2）特点：形态上——体积小，细胞核大、核仁明显
功能上——具有全能性，能发育成任何一种组织
《克隆技术》知识点过关
1、克隆：是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的分子、细胞或个体。

2、体细胞克隆动物的成功，证明了动物的细胞核具有全能性。

3、多利的克隆原理和过程。

细胞重组与克隆技术

8.14细胞重建
细胞重建的概念是我国贝时璋院士提出的。定义：体内已经存在的某种物质，可以由细胞质，甚
至细胞外的某种基质为基地，通过自组织、自装配过程，一步步地形成完整的细胞。早在20世纪30年代，贝教授在一种甲壳类动物—南京丰年虫的二倍体雌虫卵母细胞中首次发现了细胞重建的现象。细胞重建的发现，证明细胞分裂不是细胞繁殖的唯一途径，它可能是现代生物体内对地球细胞起源的反映，是简单的生命形态进化为细胞的漫长过程的一个缩影，有助于对生命进化过程的阐述
8.13细胞核移植
核移植起始于用微吸管对阿米巴等原生动物进行的核操作。
在1952年，美国人罗伯特·布里格斯和T·J·金，首先利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术。由于两栖类的蛙卵数量较多，体积较大，容易获得，操作方便。
1958—1962年，英国剑桥大学的约翰·格登教授和麦金尼尔利用瓜蟾原肠内胚层细胞核移植，培育出可育的非洲瓜蟾。
首先是核移植过程中要分离得到供体细胞和作为受体细胞的卵细胞。
其次要取处在适当发育阶段及细胞周期的受体和供体细胞，受体细胞和供体细胞处于细胞周期中的同一时期，核移植成功的几率最大。
受体细胞在细胞周期中所处的时间对转核实验成功与否的影响要大于供体细胞所处的时间的影响，一般取G2期进行核移植的效果都较好。
重于泰山，轻于鸿毛。01:21:4501:21:4501:21Thursday, November 05, 2020
安全在于心细，事故出在麻痹。20.11.520.11.501:21:4501:21:45November 5, 2020
加强自身建设，增强个人的休养。2020年11月5日上午1时21分20.11.520.11.5
另外，细胞诱导分裂成熟的因子（MPF）的活性有关。

第二章细胞工程和克隆讲义

（三）干细胞的用途
治疗遗传性疾病和恶性肿瘤。
以干细胞为种子培育成某些组织和器官，用于移植医学。
抗衰老，延年益寿。
干细胞工程
（四）干细胞治疗的进展
科学家们认识到干细胞可能成为一种“拯救生命”的有效的疾病治疗手段。
例如：小剂量纯化的造血干细胞足可使患者骨髓再生，可以避免肿瘤病人进行自体骨髓移植时所致的瘤细胞（尤其是白血病细胞）污染。
1、按细胞分化发育的潜能分类：
（1）全能性干细胞：具有分化出各种组织细胞并建成完整个体的潜能。
（2）多能性干细胞：具有分化出多种组织和细胞的潜能，但不能建成完整个体。
（3）单能性干细胞：只能使后代细胞发育成一种细胞
2、按来源
（1）胚胎干细胞：
ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。
例如：成熟的神经系统中存在的干细胞，在某些因素诱导作用下，可增殖和定向分化，给神经退行性疾病（如帕金森氏病）、骨髓损伤患者带来新的希望。
造血干细胞：
造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。
造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。
葡萄糖果糖
核糖脱氧核糖
蔗糖乳糖
4、核苷酸
-----基因物质核酸的组分
ATP是生物体内的能量通用货币
5、脂类
必需脂肪酸：亚麻酸、亚油酸
DHA(二十碳五烯酸）
EPA（二十二碳四烯酸）
磷脂是生物膜的组分
6、维生素
-----Vc VA VE
（三）组成细胞的生物大分子
1、蛋白质
2、核酸
三、细胞的形态结构
（一）原核细胞的形态结构

细胞融合技术、干细胞工程、克隆技术 PPT课件人教课标版

2．过程
3．原理：动物细胞的细胞核具有全能性。
4．应用：加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育、保护
濒危物种、克隆器官用于移植等。
【深化拓展】
1．在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须
先去掉受体卵母细胞的核？
提示：为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重
要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移
细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。
3.过程
该图是两种不同品种的植物细胞A、B进行细胞融合的过程。
C：用酶解法去掉细胞壁，获得原生质体的过程，所用酶为
纤维素酶和果胶酶； D：在诱导剂的作用下进行诱导融合，先进行膜的融合，再进行核的融合，最后形成杂种细胞E，E细胞有三种(AA型、 BB型、AB型，只有AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要进行筛选)；常用的诱导方法
3. 干细胞按来源不同又分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。
胚胎干细胞是来自胚胎；成体干细胞是来自于已出生的人的体内，如人体各种组织中的干细胞。 4．干细胞的分化
5.比较三种造血干细胞移植的优点和缺点
优点骨髓是经典的移植方法，效果可移植靠
缺点
寻找配型相同的骨髓难，捐献者和患者都要遭受很大的痛苦
C．植物体细胞杂交的最终目的是获得细胞代谢产物
D．植物体细胞杂交技术可以克服种间远缘杂交不亲和的障碍
解析：去除植物细胞壁可以用纤维素酶和果胶酶；原生质体
融合后经过一次有丝分裂产生出细胞壁标志着杂种细胞的形
成；植物体细胞杂交的目的是为了获得杂种植株；植物体细
胞杂交不经过有性生殖过程，所以可以克服远缘杂交不亲和
动物完全相同的复制。
此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、

植物细胞工程-克隆的技术

植物组织培养的程序
①培养基的配制
培养基的组成：营养物质+植物生长调节剂+0.7%~1% 琼脂，在灭菌试管中凝固成半固体。
配制好的培养基在灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。
②外植体的切取和消毒
镊子和解剖刀
外植体：离体的植物器官、组织、细胞或原生质体。
③外植体的接种和培养
愈伤组织
愈伤组织：一种由相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织。
例题：（2010·金华模拟）下列有关植物体细胞杂交的叙述，不正确的是（）
A. 用酶解法去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体 B. 诱导两种植物的原生质体融合，进而形成杂种细胞 C. 植物体细胞杂交的最终目的是获得细胞代谢产物 D. 植物体细胞杂交技术可以克服不同种间远缘杂交不亲和的障碍
例题：（2011·上海）下列关于植物组织培养的表述，错误的是（） A. 外植体可以来自于植物的任何细胞 B. 培养应在无菌条件下进行 C. 以花粉作为外植体可得到单倍体植株 D. 不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同
脱分化
植物细胞 B 原生质体 B
再分化
得到杂种植株
产生愈伤组织
原生质体融合
植物组织培养
①酶解法去除细胞壁，获得原生质体。 ②人工诱导原生质体融合，得到杂种细胞。 ③杂种细胞经组织培养，得到杂种植株。
去壁
杂种植株
原生质体融合
再生出细胞壁
杂种细胞
再分化
脱分化
什么是植物细胞工程
植物细胞工程：培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程的方法，将外源遗传物质（DNA）导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过细胞融合，显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。

高中生物：细胞工程知识点

高中生物：细胞工程知识点（一）克隆1.克隆clone：无性繁殖系（只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代…）2.克隆技术cloning：从众多基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术3.内容：（1）分子水平：基因克隆即目的基因的复制（受体细胞的无性繁殖）、分离（特定基因探针选择、钓取目的基因）过程（2）细胞水平：杂交瘤制备单克隆抗体（3）个体水平：不通过两性细胞的结合，从一个单一（体）细胞繁殖出生物个体——胚胎细胞克隆以胚胎/卵细胞作为供体、利用核移植，不是严格意义上的动物个体克隆4.条件：（1）理论条件：细胞全能性/有发育成完整新个体的全套遗传物质（根本原因）（2）基本条件：①具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞②具有能有效调控细胞核发育的细胞质物质 e.g去核卵细胞③完成胚胎发育的必要的环境条件 e.g胚胎早期培养环境/子宫5.非正面影响：丰富生物多样性，促进生物进化，维护生态平衡（二）植物克隆1.全能性表达的难易程度：(1)受精卵＞生殖细胞＞胚胎/全能干细胞＞多能（干）细胞＞专能（干）细胞＞体细胞；PS生殖细胞在一定刺激下染色体可加倍；一些动物存在孤雌生殖(2)植物细胞＞动物细胞；低等动物＞高等动物PS不同种类植物或同种植物的不同基因型个体间全能性的表达程度大不相同2.植物组织培养（植物克隆的技术基础）（1）理论基础：植物细胞全能性，即植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能（2）过程：①离体植物细胞、组织或器官（外植体）→获得愈伤组织→诱导形成试管苗→新植株PS外植体选取形成层(分生组织)部分易于诱导形成愈伤组织A.培养条件：首先是离体培养(生物体内细胞中基因在特定时间和空间条件下选择性表达，细胞分化为不同组织、器官，故无法表现出全能性)半/固体培养基（固体为例）a.营养物质：水、无机盐、蔗糖、维生素、有机添加剂(氨基酸、琼脂凝固剂等)b.植物激素/生长调节剂（适当浓度配比诱导分化出芽/根的顶端分生组织/花）——CTK中等量IAA少量诱导脱分化，CTK、IAA比例合适诱导根芽分化c.无菌条件（外植体70%酒精消毒、器械高温蒸汽灭菌）——杂菌争夺产毒d.适宜的pH、温度和渗透压B.光照：若外植体是（带叶）茎段，不经历脱分化再分化，组培全过程均需要光照；若外植体是非光合作用部位（如胡萝卜块根），再分化成芽后光照C.试管苗移栽前需炼苗（草炭土/蛭石，逐渐降湿）D.愈伤组织：排列疏松的高度液泡化的活的薄壁细胞团②外植体→愈伤组织→摇床液体悬浮培养分散成单细胞→胚状体→人工种子PS 单细胞植物克隆，类似受精卵的卵裂、分化、器官发生、形态建成单细胞：细胞质丰富、液泡小、细胞核大（胚性细胞特征）③酶解细胞壁→原生质体培养→新植株（2）用途：微型繁殖、制造人工种子(胚状体阶段)、单倍体育种、作物脱毒（植物分生组织细胞，分裂旺盛病毒极少Cf抗病毒）、在培养基中加入不同浓度的氯化钠溶液，可诱发和筛选抗盐植株细胞产物工厂化生产（愈伤组织阶段已可，试管培养苗、细胞培养反应器也可）(3)长期培养后的全能性下降原因：染色体畸变、核变异、非整倍体产生；细胞或组织中激素平衡被打破；细胞对外源生长物质的敏感性改变；形成缺乏成胚性的细胞系——植株在多次继代培养后，会逐渐丧失细胞全能性的表达能力3.原生质体融合/植物体细胞杂交（不同植物）获得原生质体：在甘露醇溶液环境（较高渗透压）中用纤维素酶和果胶酶混合液处理用网筛过滤原生质体到离心管内，离心后收集沉淀物，用等渗溶液洗涤；检验原生质体是否符合要求：依据渗透作用原理，采用低渗胀破法（见比较表格）4.植物细胞工程：培养植物细胞（包括原生质体），借用基因工程技术将外源DNA导入受体细胞或通过细胞融合将不同源的遗传物质重新组合，再通过细胞培养，获得具有特定性状的植株C细胞工程：细胞培养和细胞融合（若基因型不同为细胞杂交）——基因定位：利用细胞杂交中染色体丢失与特定基因产物的对应关系（三）动物细胞工程1. 动物细胞培养指明“动物”细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

细胞工程细胞融合与单克隆抗体技术PPT课件

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与多5克．隆2抗．体2（单P克cA隆b，抗p体ol的yc特lon性a（l a见nt图ib表od）y）
相比，MAb具有以下显著特点：高度均质性——结构、亲和力、亲合力相同；高度特异性——单一抗原决定簇，不发生交叉反应；高效价——ELISA（酶联免疫吸附测定法）效价达成10.6-10.8；来源稳定，可大量生产；容易标准化。
药物治疗排异反应、TNF-αMAb治疗脓毒症和类风湿性关节炎。
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5．2 单克隆抗体技术（杂交瘤技术）
●杂交瘤细胞 ——是指肿瘤细胞与体细胞融合形成
的杂交细胞；它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力，又具有参与融合的体细胞的一些特征。
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●杂交瘤技术（hydridoma technique，也称MAb制备技术） ——是指建立杂交瘤细胞系的技术；
成由亲本细胞同核体及异核体组成的细胞混合
群体。不同的细胞在体外培养条件下有着不同
的生长特性。在未融合的亲本细胞中，缺乏增
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●由于杂交细胞在融合处理后的细胞群体中数量少，生长缓慢，往往受到优势生长的亲本细胞抑制，需要筛选；
●杂交细胞在体外培养过程中，可能因为基因的丢失或突变，使其原有的遗传表型消失或减弱，应定期检测杂交细胞遗传表现型，进行控制。
●狭义的杂交细胞遗传表型的控制——是指基于对杂交细胞的基因型和（或）表型动态分析的基础上，使有利用价值或人们关注的表型得到维持的措施。

细胞工程主要技术PPT课件

基因修饰技术
通过基因敲除、基因转录和基因编辑等技术对动物基因进行修饰，以获得具有特定性状的
动物个体。
植物克隆技术
组织培养技术
将植物的离体组织或细胞培养成植株的技术。
植物基因转化技术
将外源基因导入植物细胞或组织中，再通过组织培养获得转基因植株。
植物细胞悬浮培养技术
将植物细胞悬浮在培养基中，进行大规模培养，以生产次生代谢产物或培育新品种。
基因敲除技术
基因敲除技术是指通过特定的方法将生物体中的某个基因敲除或沉默，以研究其功能的一种技术。
基因敲除技术可以用于研究基因的功能和作用机制，以及用于治疗某些遗传性疾病。
该技术通过同源重组或CRISPR-Cas9 等技术，将靶基因敲除或使其失效，以研究其对生物体生长发育和代谢等方面的作用。
成体干细胞在医学上具有广泛的应用前景，可用于治疗心肌梗死、脑梗塞等疾病。
诱导多能干细胞（iPS）
诱导多能干细胞（iPS）是通过基因工程技术将成体细胞诱导回转录为胚胎干细胞样细胞的干细胞。
iPS细胞的产生避免了胚胎干细胞的伦理道德问题，同时具有与胚胎干细胞相似的多能性。
iPS细胞在医学上具有巨大的应用潜力，可用于疾病模型的建立、药物筛选和个性化治疗等领域。
过程
02
将两个待融合的细胞用聚乙二醇处理，使细胞膜表面张力降低，
细胞膜相互靠近并融合。
应用
03
用于制备杂交瘤细胞、基因转导等。
细胞生物融合
01
02
03
原理
利用病毒或细菌等生物因子诱导细胞融合。
过程
将病毒或细菌与待融合的细胞共培养，病毒或细菌会吸附在细胞表面并诱导细胞融合。

克隆技术

第七章
细胞重组与克隆技术

7.1 概念细胞重组：又叫细胞拆合，是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的技术。

意义： ① 细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能。 ② 细胞重组技术结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状的产生新的产物。

*1958年到1962年，英国剑桥大学约翰. 格登（John Gurdon) 教授和麦金尼尔（Machineer)利用爪蟾上肠上皮细胞核移植到未受精的卵细胞中培育出可育的非洲爪蟾。

1981年，瑞士日内瓦大学的伊尔门泽首次将小鼠囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，培养发育到囊胚期，移入同步孕小鼠的子宫内成功。 1983年，显微技术发展和完善促进了细胞核移植技术的发展，1984年科学家维拉德森成功克隆了一只小绵羊，开始家畜哺乳动物克隆，后来先后克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的
胚胎，当时采用的是胚胎细胞克隆技术。

1997年，克隆羊多利诞生，这事第一个体细胞克隆的高等哺乳动物。我国动物细胞核移植开始于20世纪50年代，主要是在两栖类和鱼类上进行，1990年后，我国利用胚胎细胞核移植方法相继得到了克隆山羊、克隆牛、小鼠等。
克隆动物研究
2003年4月19日，非洲大陆首个克隆动物——小牛‚富特‛出生。黑白相间的‚富特‛ 有4个‚妈妈‛。‚富特‛的第一位‚母亲‛ 是一头编号为LMJC 865的母牛，她鼎盛期日产78升牛奶的成绩曾是南非奶牛最高的产奶纪录。从她的耳部提取了一个体细胞，然后将其中的DNA片段植入另一头母牛取掉了DNA遗传基因的卵子中。该胚胎在试管中培育了8天，随后被植入第三头母牛的体内。 4月19日，研究人员对这头奶牛进行了剖腹产手术，‚富特‛平安降生。现在每天照顾、喂养 ‚富特‛的奶牛则是它的第四位 ‚母亲‛。

细胞工程中克隆原理的应用

细胞工程中克隆原理的应用一、克隆原理细胞工程中的克隆是指根据已有细胞的遗传信息，通过人为手段复制出与原细胞完全一样的新细胞的过程。

克隆原理主要有两种方法：基因克隆和细胞克隆。

1. 基因克隆基因克隆是指通过DNA重组技术将感兴趣的基因从一个生物体中剪切出来，并将其插入到另一个生物体的染色体上，使其在新生物体中得以表达。

基因克隆的主要步骤包括：•DNA提取：从原细胞中提取出包含目标基因的DNA片段；•DNA剪切：使用限制酶将目标基因从DNA片段中剪切出来；•DNA连接：将目标基因插入到载体DNA上，形成重组DNA；•转化：将重组DNA导入到目标细胞中，使其表达目标基因。

基因克隆技术的应用非常广泛，包括农业、医学、药物研发等领域。

通过基因克隆，科学家可以将具有特定性状的基因导入作物中，使其具有抗病虫害、耐逆性等优点，提高农作物的产量和品质；同时，基因克隆也用于生产重要药物，如胰岛素和人血红蛋白等。

2. 细胞克隆细胞克隆是指利用体细胞核转移技术，将一个成熟细胞的细胞核移植到一个没有细胞核的细胞中，形成一个与原细胞完全一样的细胞。

细胞克隆的主要步骤包括：•提取卵细胞：从一个捐助者中提取出卵细胞；•清除卵细胞细胞核：利用显微注射将卵细胞的细胞核取出；•体细胞核注射：将捐助者的体细胞核注入已去核的卵细胞；•电融合：用电脉冲将体细胞与卵细胞融合；•培养：将融合细胞培养至囊胚阶段；•移植：将囊胚移植到一个母体中进行孕育。

细胞克隆技术主要应用于动物繁殖、医学研究和组织工程等领域。

例如，通过细胞克隆可以实现动物的复制繁殖，解决珍贵动物濒危问题；在医学研究中，细胞克隆可以用于研究疾病的发生机制和药物疗效的评估；在组织工程中，细胞克隆可以用于培养器官和组织，为患者提供移植源。

二、细胞工程中克隆原理的应用细胞工程是一个综合性学科，细胞克隆作为其中的一个重要技术手段，在以下几个领域得到了广泛的应用。

1. 农业领域细胞工程中的克隆技术在农业上有着广泛的应用。

动物细胞工程—细胞核移植与克隆

重组胚胎构建
应用
畜牧业医疗健康
胚胎移植
克隆动物
细胞核移植与克隆
课后思考用体细胞核移植方法生产的克隆动物，是否对体细胞供体动物进行了 100%的复制？为什么？
原理
动物细胞核具有全能性
胚胎细胞核移植
细胞分化程度低，恢复全能性容易
分类
体细胞核移植
细胞分化程度高，恢复全能性不容易
细胞核移植与克隆
核移植技术的流程
细胞核移植与克隆
母绵羊A
母绵羊B
取供体细胞传代培养 10代以内
的细胞
融合方法：电刺激
乳腺细胞（体细胞）
核移植
提取细胞核
新的卵细胞发育成早期胚胎
动物生物技术
细胞核移植与克隆
第一章
细胞核移植与克隆
细胞核移植与克隆
你知道小羊 “ 多莉 ” 吗？
细胞核移植与克隆
动物细胞核移植技术
动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。
细胞核移植与克隆
胚胎移植
母绵羊 C
“多莉”
未受精的卵细胞
去核卵细胞
MⅡ期卵母细胞
细胞核移植与克隆
体细胞核移植技术的应用
加速家畜遗传改良保护濒危物种生产医用蛋白质组织器官的移植认识胚胎发育和衰老过程研究疾病的发展历程
细胞核移植与克隆
课堂小结
概念
胚胎细胞核移植
核分类体细胞核移植来自移植细胞核采集
过程去核卵母细胞

细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术

细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术
体细胞克隆高产奶牛
细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术
2006、2，美国《科学》杂志１１日宣布，韩国和美国科学家成功克隆出了人类早期胚胎，并从中提取出胚胎干细胞。这是科学家首次利用克隆技术获得人类胚胎干细胞。
汉城国立大学和美国密歇根州立大学等机构的科学家参与了这项研究。１６名健康妇女为这项研究志愿捐献了２４２个卵细胞以及被称为卵丘细胞的体细胞。
核体需5-10h再贴壁
培养
分离
完整细胞需2h （菲可液梯度离心）
细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术
细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术
细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术
●微核体的制备： CB具有排核作用，形成的微核体；
0．1ug/mL秋水仙胺，48h，处理细胞细胞微核化离心14000r/min、20min， 80-90% 1-3%牛血清密度梯度离心（见图5-4）
细胞工程第6章：细胞拆合与克隆技术
科学家们从卵丘细胞内提取出细胞核，然后将其植入同一位妇女去除了细胞核的卵细胞内，并采用化学手段刺激卵细胞分裂，共有３０个克隆细胞经过约７天的时间发育到至少几十个细胞组成的、被称为胚囊的早期胚胎阶段。科学家们从这些胚囊中分离出２０个内层细胞团，并在此基础上最终获得一个人类胚胎干细胞系。实验显示，利用这种办法获得的胚胎干细胞具有多能性，可分化成骨骼细胞、肌肉细胞和未成熟的脑细胞等多种细胞类型。
●去卵膜和卵核——用玻璃微针（尖为2-4um）
鱼卵——借助第二极体标志，去核；
两栖卵——紫外线去核；
哺乳卵——借助第一极体；
●供体细胞制备：
胚胎或组织机械切割
置细胞分离液

细胞重组与克隆

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二、细胞重组技术：（一）几个定义：胞质体：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。微质体：植物去核原生质。核体：在细胞去核过程中，分离出的核带有少量胞
质并围有质膜称为核体。微细胞（微核体）：指含有一条或几条染色体（即
只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。
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（二）细胞重组的几种形式：（1）胞质杂种（2）微细胞异核体（3）重组细胞（核移植技术）：将一个
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（3）细胞电泳
在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（cell electrophoresis）。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。不同类型的细胞在电场中的泳动速度不同，可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。
这种微细胞仅含有一个或数个染色体的dna也是细胞拆合工程的一种有用材2829六动物细胞的重组及细胞质杂交用上述方法从活细胞中拆散出来的胞质体核体微细胞为材料通过显微操纵术在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合加人病毒或化学物质如聚乙二醇peg等融合因子经过一段时间的作用可以把它们重新装配成新的活细胞
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3、微细胞秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有
丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种微细胞仅含有一个或数个染色体的 DNA，也是细胞拆合工程的一种有用材料。
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2、核体制备
防止夹杂完整细胞和胞质体。 1. 预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。 2.可在去核处理后，收集样品，接种于培养皿内，温育l-2h，重复l-2次，可从上清液中收集得到较纯净的核体。 3.采用梯度密度离心法，去除胞质体。可使核体的纯度高达99％。

第8章细胞重组与克隆技术

(3)流式细胞仪分离法这种方法是以免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为 50μm的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以10m/s的速度喷出。
3. 细胞破碎方法细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法包括： (1)超声波破碎法原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。 (2)反复冻融法使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱(-70 ℃) 或液氮罐内冻结后，在37℃复温融化，重复3~4 次操作使细胞壁破碎。
第八章细胞重组与克隆技术
一. 细胞重组细胞重组(又叫细胞拆合)是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。
（一）特点与意义细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程。细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能。尤其是细胞重组结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物，因此细胞重组技术现已成为现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一。只有了解了生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞器重组技术对于揭示细胞活动规律具有重要义。
(2)核体与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。为了生产大量的核体，必须采用一系列的纯化技术，以防夹杂完整细胞和胞质体。通过去核前作预离心，可去除贴壁不牢的完整细胞。也可在去核处理后，从离心管底部收集样品，接种于培养皿内，温育1~2h，由于核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁率，可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复 1-2次，可使核体的纯度高达99％。

9细胞拆分重组与克隆技术2

聚核糖体的分离
• 核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒，酸蛋白颗粒，附着在粗面内质网的称固着核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体，核糖体，分散在细胞内的称游离核糖体，数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体，糖体，一般用差速离心法可分离出聚核糖体。
微粒体分离
• 微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，含核微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡，糖核酸，蛋白质和脂类，糖核酸，蛋白质和脂类，分离微粒体的方法是利用分级离心法，法是利用分级离心法，去掉细胞核和线粒体后，经超速离心而制备。体后，经超速离心而制备。
• (6)沉淀物悬浮于240ml溶液B中，以2000g离心10 (6)沉淀物悬浮于240ml溶液B 2000g离心离心10 沉淀物悬浮于240ml溶液分钟。分钟。 • •(7)弃上清，沉淀物悬浮于190ml溶液C中，取6支 (7)弃上清 190ml溶液 (7)弃上清，沉淀物悬浮于190ml溶液C 超速离心管，每管加5mL溶液C 5mL溶液超速离心管，每管加5mL溶液C，然后把细胞核悬液铺在溶液C上层， 25000r/min离心60分钟离心60分钟。液铺在溶液C上层，以25000r/min离心60分钟。 • •(8)弃去上清，用溶液A轻轻荡洗管壁及沉淀物表 (8)弃去上清 (8)弃去上清，用溶液A 面两次，将离心管倒置，用滤纸擦干管口。面两次，将离心管倒置，用滤纸擦干管口。 • •(9)向离心管底部滴加几滴溶液A，用玻璃棒轻轻 (9)向离心管底部滴加几滴溶液 (9)向离心管底部滴加几滴溶液A 搅匀，然后补加30mL溶液A 30mL溶液搅匀，然后补加30mL溶液A。 • •(10)以2000g离心20分钟，弃上清液，沉淀物为 (10)以离心20分钟， (10) 2000g离心20分钟弃上清液，纯化的肝细胞核。纯化的肝细胞核。