Chapter 8-HPLC and SFC

Instrumental Analysis
HPLC
2. 液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Partition Chromatography） 固定相：通常使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。 最常用的强极性固定液 β，β′一氧二丙腈、中等极性的聚乙二醇、 非极性的角鲨烷等 流动相：根据流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分
d. 对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱
e. 波长可选，易于操作
Disadvantages：对紫外光完全不吸收的试样不能检测
溶剂的选择受到限制
Instrumental Analysis
HPLC
紫外光度检测器
光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；阵列由1024个光电二极管阵列，各
检测一窄段波长，计算机快速处理，三维立体谱图
配色谱和反相分配色谱
正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，适用于极性 化合物的分离：极性小的先流出，极性大的后流出
反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，适用于非极
性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反
Instrumental Analysis
HPLC
2. 液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Partition Chromatography） 固定相：通常使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。 最常用的强极性固定液 β，β′一氧二丙腈、中等极性的聚乙二醇、 非极性的角鲨烷等 流动相：根据流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分
特点：1）键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，
适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子k” 值范围宽的样品 2 ）键合到载体表面的官能团可以是各种极性 ，因此它适用于种类繁多样品的分离
Instrumental Analysis
HPLC
3. 化学键合相色谱法（Chemically Bonded Phase Chromatography）
Hຫໍສະໝຸດ BaiduLC
技术特点
液体为流动相的柱色谱分离分析方法

与GC区别：
1）流动相：GC - 惰性gas，分离取决组分与固定相作用力 HPLC - 液体，与组分有一定亲和力，分离取决于 三者 相互作用的结果 2）操作条件：（通常）室温条件，固定相颗粒细，入口加压

适合分析难挥发、热不稳定、离子型物质和生物大分子等
HPLC
HPLC色谱仪的组成
4. 梯度洗脱
Advantages：改善峰形，提高柱效，缩短分析时间
5. 进样器：注射器或高压进样阀（六通阀, six-way valve） 6. 色谱柱：常用标准柱型内径为4.6 或 3.9 mm，长度为10～30 cm
的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 ～10 μm，柱效以理论塔板数计
大约 7000 ～ 10000（柱子填充质量好坏对柱效影响很大。对于细粒度的
填料（＜ 20 μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压
泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用）
Instrumental Analysis
HPLC
HPLC色谱仪的组成
7. 检测器：常用紫外吸收、示差折光、荧光和安培检测器 溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器 总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，
荧光检测器
浓度型检测器 高灵敏度、高选择性
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、
卟啉类化合物、农药、药物、氨基 酸、甾类化合物等有响应
非荧光性物质通过化学衍生后进
行检测
Instrumental Analysis
HPLC
荧光检测器
standard cell flow through cell
属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等
（P168 Table 8.1 HPLC各种检测器性能比较）
Instrumental Analysis
HPLC
紫外光度检测器
Advantages：
a. 灵敏度高
b. 线性范围宽 c. 流通池可较小（Size：1 × 10 mm，Volume: 8 μL）
I0
I0 F I0 F F
F
I0
Instrumental Analysis
HPLC
示差折光率检测器
除紫外检测器之外应用最多的检测器
可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差
值与浓度呈正比 通用型检测器（每种物 质具有不同的折光指数） 灵敏度低、对温度敏感、 不能用于梯度洗脱
（GC：gas，低沸点，易挥发，20%）
Instrumental Analysis
Schimadzu LC -10A
HPLC
适用分析物质
溶解于流动相 难挥发
热不稳定 离子型物质 生物大分子
Instrumental Analysis 仪器组成
HPLC
Instrumental Analysis
键合固定相类型
制备键合固定相的载体 - 硅胶：利用硅胶表面的硅醇基 （Si一OH）与不同极性官能团的有机分子可成键得到各种性
能的固定相。一般可分三类
HPLC
HPLC色谱仪的组成
1. 贮液器：存放溶剂，耐腐蚀，对溶剂惰性（1-2 L玻璃瓶） 2. 脱气器：防止气泡产生进入检测器，使噪声加剧，不能正常检测， 可用氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的气体（离线超声波振荡脱气、在 线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气） 3. 高压泵：几MPa-数十MPa，分为恒压泵和横流泵两种
往复式高压恒流泵
Instrumental Analysis
HPLC
HPLC色谱仪的组成
4. 梯度洗脱装置
分离过程中通过逐渐改变流动相组成来增加洗脱能力
梯度洗脱（淋洗, Gradient Elution） 低压梯度 PUMP 高压梯度 PUMP1 PUMP2
Instrumental Analysis
Problem：固定液在载体上易流失
化学键合固定相
将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面
Instrumental Analysis
HPLC
3. 化学键合相色谱法（Chemically Bonded Phase Chromatography）
化学键合相：通过化学反应将有机分子键合在载体 表面形成的柱填充剂
d. 对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱
e. 波长可选，易于操作
X Disadvantages：对紫外光完全不吸收的试样不能检测
溶剂的选择受到限制
Instrumental Analysis
HPLC
紫外光度检测器
Advantages：
a. 灵敏度高
b. 线性范围宽 c. 流通池可较小（1 × 10 mm ，Vol= 8 μL）
Instrumental Analysis
HPLC
固定相（Stationary Phase）
承受高压能力：分为刚性固体和硬胶两大类 刚性固体：二氧化硅为基质，承受7.0×108～1.0×109 Pa 的高压可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒 目前最广泛使用的一种固定相 硬胶： 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中 由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成 可承受压力上限为3.5×108 Pa
对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂
洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量，ε0 越大， 表示洗脱剂的极性越强。
P170表8-3：常用溶剂在不同固定相上的 ε0值。在硅胶吸附剂
中ε0 值的顺序相同，数值可换算（ε0 硅胶 = 0.77×ε0 氧化铝）
谱
法
Instrumental Analysis
d. 对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱
e. 波长可选，易于操作
Disadvantages：对紫外光完全不吸收的试样不能检测
溶剂的选择受到限制
Instrumental Analysis
HPLC
紫外光度检测器
Advantages：
a. 灵敏度高
b. 线性范围宽 c. 流通池可较小（1 × 10 mm ，Vol= 8 μL）
Xad + nS
“相似相溶” 分离几何异构体
Instrumental Analysis
HPLC
1. 液-固（吸附）色谱法（ Liquid-Solid Chromatography） （吸附） 固定相：表面多孔和全多孔微粒型硅胶和氧化铝，5-10 µm 流动相（洗脱剂） 对极性大的试样采用极性强的洗脱剂
表面存在吸附中心
实质：样品中各组分在固定相上的吸附作用不同进行分离 分离原理：当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面
的活性中心就要吸附流动相分子。当试样分子（X）被流动相
带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就会取代数目 相当已被吸附的流动相溶剂分子 - 固定相表面发生竞争吸附
X + nSad
往复式高压恒流泵
Instrumental Analysis
HPLC
HPLC色谱仪的组成
1. 贮液器：存放溶剂，耐腐蚀，对溶剂惰性（1-2 L玻璃瓶） 2. 脱气器：防止气泡产生进入检测器，使噪声加剧，不能正常检测， 可用氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的气体（离线超声波振荡脱气、在 线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气） 3. 高压泵：几MPa-数十MPa，分为恒压泵和横流泵两种
往复式高压恒流泵
Instrumental Analysis
HPLC
HPLC色谱仪的组成
1. 贮液器：存放溶剂，耐腐蚀，对溶剂惰性（1-2 L玻璃瓶） 2. 脱气器：防止气泡产生进入检测器，使噪声加剧，不能正常检测， 可用氦气鼓泡来驱除流动相中溶解的气体（离线超声波振荡脱气、在 线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气） 3. 高压泵：几MPa-数十MPa，分为恒压泵和横流泵两种
Instrumental Analysis
HPLC
紫外检测器和光电二极管阵列检测器比较
普通检测器
光电二极管阵列检测器
Instrumental Analysis
HPLC
获得组分在整个波长范围内的光谱信息 确定最佳选择性和灵敏度的检测波长
Instrumental Analysis
HPLC
产生沉淀并在柱中沉积
(4) 沸点高于55 C：避免因挥发造成损失引起组成比例改变/气泡 (5) 粘度低：高会降低组分扩散系数，造成传质速率慢，柱效下降 (6) 与检测器相匹配：(当使用UV检测器时，流动相不应有UV Abs)
Instrumental Analysis
HPLC
1. 液-固（吸附）色谱法（ Liquid-Solid Chromatography） （吸附） 流动相为液体，固体吸附剂为固定相，多孔固体颗粒，
配色谱和反相分配色谱
正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，适用于极性 化合物的分离：极性小的先流出，极性大的后流出
反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，适用于非极
性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反
Instrumental Analysis
HPLC
2. 液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Partition Chromatography）
仪器分析
Instrumental Analysis
高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Column PUMP
Detector W
Data station (Recorder)
Mobile phase
or Collection
Instrumental Analysis
孔隙深度：分为表面多孔型和全多孔型固定相两类
分离模式
Instrumental Analysis 流动相的选择（Mobile Phase） 对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争
HPLC
(1) 纯度高：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱，增加检测器噪声 (2) 化学稳定性好：避免与固定相发生作用使柱效下降或损坏柱子 (3) 对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止
HPLC
2. 液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Partition Chromatography） 固定相和流动相都是液体，但两相互不相容（萃取） Ki iaq Mobile phase
iorg
Stationary phase
组分在两种互不相溶的液体中溶解度不同，具有不同的分配系数 分配过程在柱中进行，分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差 速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分