下分子生物学基本研究法课件

DNA聚合酶
延伸诱变寡核苷酸引物
细菌转化
筛选引入突变的环状DNA
下分子生物学基本研究法
2、重叠延伸技术
已知序列DNA模板
反向 引物
正向
反 向
互
诱变 补
引物
反向 诱变 引物
正向 引物
R2
FM P RM
F2
产物 1 C 2 产物
R
在重叠区发生退火
PCR3 形成全长双链突变DNA
使用引物F2和R2扩增 全长突变DNA片段
PCR4
下分子生物学基本研究法
3、大引物诱变法
已知序列wenku.baidu.comNA模板
反向引物 （R1）
正向诱变 引物（M）
退火温度PCR2>PCR1
PCR1产物 双链大引物 退火和野生型基因复性
正向引物（F2） PCR2
全长突变DNA片段
下分子生物学基本研究法
PCR介导的基因定点突变方法的优势？ 1、突变体回收率高。 2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位
原位杂交是分子杂交的一种，是在切片上进 行的，能显微定位 。
可分为：RNA原位杂交和染色体原位杂交。
下分子生物学基本研究法
• RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛 生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织 切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分 子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记 或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定 性定量分析。
下分子生物学基本研究法
• 寡核苷酸介导的DNA突变技术（P198图6-6） 以PCR为基础：重叠延伸技术（P199图6-7） 大引物诱变法（P200图6-8）
以上三种方法虽不同，但原理都一致。
下分子生物学基本研究法
1、寡聚核苷酸介导的DNA突变技术
已知序列的环状DNA 变性
定点突变
模板
人工合成一段引物
下分子生物学基本研究法
基因敲除技术分为： 完全基因敲除：用同源重组法完全消除细胞或者
动植物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除：用定位重组系统实现特定时间
和空间的基因敲除。 同源重组：是指发生在非姐妹染色单体之间或 同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或 分子之内的重新组合。
下分子生物学基本研究法
下分子生物学基本研究法
步骤：
（1）选择特定的限制内切酶分离转录产物中这些 代表基因特异性的9-10个碱基的核苷酸序列并制
成标签。
（2）将这些标签连接在一起、克隆和测序。 （3）根据其占总标签的比例即可分析其对应编码 基因的表达频率。（图P194） AE？TE？双标签？如何分离3’端酶切片段？
下分子生物学基本研究法
（1）完全基因敲除策略
插入基因包括正向选择标记基因和负向选择标记基 因。 正向选择标记基因neor(新霉素抗性基因)通常被插 入到靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重 组置换靶基因最重要的功能域，以使靶基因彻底失 活。 利用筛选培养基检测是否存在正向选择标记基因， 可以判定打靶载体是否整合到细胞的基因组中。
下分子生物学基本研究法
荧光原位杂交(FISH)： 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用
原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列 结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆 抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
优点：不需要放射性同位素，实验周期短， 检测灵敏度高。
下分子生物学基本研究法
人肌糖原磷酸酶 基因在11号染色 体的定位结果。
下分子生物学基本研究法
平衡剪接
5′ss
3′ss
类型
5′ss
5′选择性剪接
5′ss
3 ′选择性剪接
5′ss
外显子遗漏 剪接 相互排斥剪接 5′ss
5′ss
3′ss
3′ss 3′ss 3′ss
3′ss
下分子生物学基本研究法
3、原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）
用标记的核酸探针，经放射自显影（放射性 同位素，如3H、35S、32P）或非放射（如生 物素、地高辛等）检测体系（酶促免疫显色）， 在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行 定位和相对定量研究的一种手段。
点引入突变。 3、可在同一试管中完成所有反应。 4、快速、简便。
下分子生物学基本研究法
6.2 基因敲除技术 P200 概念：
基因敲除技术（gene knockout)又称基因 打 靶（gene targeting）。这种技术是通过基因工程 的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除， 或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲 入），然后从整体上观察实验动物，从而推测相 应基因的功能。这种人为地把实验动物某一种有 功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。
• SAGE是基因表达定性和定量研究的一种有效工 具，非常适合于比较不同发育状态或疾病状态 的生物基因表达。
• 另外SAGE能够接近完整地获得基因组表达信息， 能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因 表达信息。
下分子生物学基本研究法
2. RNA选择性剪接
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式（选择不同 的剪切位点组合）从一个mRNA前体产生不同的mRNA 剪接异构体的过程。 mRNA前体的选择性剪接，使一个基因翻译为多种 蛋白质序列，极大地增加了蛋白质的多样性和基因 表达的复杂程度，是基因表达多样性的重要表现形 式。
第六章
分子生物学研究法 （下）
下分子生物学基本研究法
本章主要内容
✓基因表达研究技术 ✓基因敲除技术 ✓蛋白质及RNA相互作用技术 ✓基因芯片技术 ✓其他分子生物学技术
下分子生物学基本研究法
6.1 基因表达研究技术
1、基因表达系列分析技术（SAGE） P193 （serial analysis of gene expression）
下分子生物学基本研究法
下分子生物学基本研究法
4、基因定点突变（site-directed mutagenesis） 技术 • 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编
码的氨基酸序列。 • 常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、
催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于 改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、 引入新的酶切位点等。
是一种以测序为基础定量分析基因组表达模式的技术， 能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信 息。
SAGE的主要依据:
1.一个9～10碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的 信息，能够唯一确认一种转录物。
2.如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序， 并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入 计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物 进行分析。