蛋白质工程和基因工程的简介
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3.要考虑成型工艺，合理计 算累积公差，以防按键手感 不良。
DNA测序的基本战略
设法产生带标记的不同长度的成套DNA片 段，各带有标记的片段起点相同、终点不同 ，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都 有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差 一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后 ，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA 片段就可读出待测DNA的碱基序列。
2 . 文库的Leabharlann Baidu建
2021/3/9
28
基因文库
基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的 分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部 基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以 备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其 为genomic library。
computer analysis
样品槽
2021/3/9
成象透镜 聚焦透镜
高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件
凝胶中DNA移动方向
输入光学系统
激光器
23
DNA的化学测序示意图
2021/3/9
反应试剂 G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸 T+C反应：肼 C反应：NaCl+肼
24
测序技术进展
同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳
TP
列 GGCCA GGCCATCGTTGA
分
GGC
GGCC GGCCATC
GGCCATCG GGCCATCGTTG
GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT
析
的
AC G T
原 理
GGCCATCGTTGA
电 GGCCATCGTTG
泳 GGCCATCGTT
方
GGCCATCGT
向
GGCCATCG
+
Joining
Plansmid vector
Recombinant DNA molecule
Introduction into host cells by transformation of viral infection
Host chromateme
Cloning
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddATP (terminator)
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddCTP
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddGTP
SDS-Polyacrylamide 202g1e/3l /9
Polymer sheet
Autoradiogram
11
DNA重组技术的应用
(1) 开辟生物学研究的新纪元 •反向生物学（invese biology）的诞生
（2）促进生物技术产业的兴起 •基因药物 •基因诊断和治疗 •转基因动植物
2021/3/9
30
基因文库和cDNA文库的建立
与放射性标记 DNA探针杂交
2021/3/9
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
10
Southern和Western印迹法
DNA frangment
Electrophoresis
Transfer of DNA by blotting
32P-labled DNA probe
Autoradiography
工
程
2021/3/9
带有外源基因 的Ti质粒
Ti辅助DNA 给体质粒
宿主特 异性
Ti辅助DNA 给体质粒
Ti质粒转移并插 入植物DNA
植物DNA
14
第二节 蛋白质工程简介
在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋 白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往 并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提 出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进 行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展， 生物工程的重要组成部分。
GGCCATC
GGCCAT
GGCCA
GGCC
2021/3/9
GGC
3´
5´
A
T
G
C
T
A
T
A
读出模板 G 读出模板 C
互补序列 C 序列 G
T
A
A
T
C
G
C
G
5´
231´
5´ CTGACTTCGACAAAGAA
3´未知序列的单链DNA
TGTT 放射性标记的引物
DNA的 Sanger测
序法 (酶法)
Klenow酶 dNTP
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP
反应混合物
ddG ddG ddG ddG
较大片段
凝胶电泳 ACT G
2021/3/9 较小片段
读出模板 互补序列
3´
5´
G A C T G A A G C T G T T
读出待测 序列
C T G A C T T C G A C A A
5´
32´2
DNA的测序仪示意图
蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级 结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级 结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经 周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。
研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞 因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以 及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。
转化寄主细 胞
蛋白质
制备合成肽
制备对所编码蛋白 专一的抗体
测定出AA 顺序
合成cDNA 探针
用Southern印迹法 筛选DNA文库
蛋白质
2021/3/9
制备专一的抗体
沉淀核糖体 分离mRNA
基因或 c1D7 NA
第三节 核酸研究技术简介
一、DNA序列测定 二、基因文库与cDNA文库 三、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
用NaOH菌体裂解 DNA变性
32P-cDNA
单链DNA结 合到膜上
杂交 放射自显影
原位杂交法筛选 DNA重组体图解
2021/3/9
与放射性cDNA杂
交的菌落的斑点
9
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
Southern 印迹法
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜
•2蛋021/白3/9 质技术和核酸技术的相互增强
15
生物酶工程示意图
遗传设计
酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案
2021/3/9
效用 发 展
产品
新酶 克隆酶 突变酶
DNA重组 技术
遗传修饰
DNA重组 技术
酶基因
16
蛋白质技术和核酸技术的相互增强
插入表达载 体
基因或 cDNA
推导出AA 顺序
为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库应 含的克隆数的计算公式如下：
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
N cDNA文库所包含克隆的数目；
p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%；
1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。
2021/3/9
12
胰岛素原的人工合成
胰脏
胰岛素原基因
胰岛素原
反转录酶
与质粒 连接
感染 E.coli
(A)n 胰岛素原mRNA
cDNA
重组质粒
mRNA
转化细菌
2021/3/9
13
I 二元载体系统
外源基因
Ti
质
Ti辅助质粒
粒
为
载
II 共整合载体
体
的
植
宿主特 异性
pBR型质粒（ 整合
给体质粒）
物
基
因
III T-DNA的转移与整合
同位素标记 平板电泳
ACG T
单色荧光标记 多色荧光标记 平板电泳 毛细管电泳
ACG T
测序图谱
T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T
2021/3/9
25
引物标记法测序(Dye Primer)
一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。
2021/3/9
2021/3/9
18
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的 开关按键来实现功能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图 ：
按
PCBA
键
开关 键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型， 尽量选择平头类的按键，以 防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计 间隙建议留0.05~0.1mm，以 防按键死键。
第十六章 基因工程和蛋白质工程简介
第一节 DNA重组与基因工程 第二节 蛋白质工程简介 第三节 核酸研究技术简介
2021/3/9
返回 1
第一节 DNA重组和基因工程
基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使 外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning， 克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物 原有的遗传性状。
噬菌体感染大肠杆菌的途径
2021/3/9
6
DNA重组体的筛选
• 载体特征的直接筛选 • 菌落的原位杂交 • 免疫学方法
2021/3/9
7
如果外源DNA插 入，氨卞青霉素 抗性基因失活
如果外源DNA插 入，四环素抗性基 因失活
pBR322质粒结构
2021/3/9
8
复印至硝酸 纤维素膜上
细菌菌落
反应结束后， 将4管反应液混 合，经乙醇沉淀 后上样
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddTTP
26
终止法测序(Dye Terminator)
一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)
unlabeled primer template DNA
29
cDNA文库
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外
显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使 编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加 工成熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表 达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有 一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都 通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被 克隆的总和称为cDNA文库。 RNA病毒的基因组是RNA，也必须将RNA先 转录成cDNA，再建立文库。
一、DNA重组的技术路线
二、基因工程的应用与前景
三、DNA体外重组常用的酶
2021/3/9
2
DNA重组的 技术路线
1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定
2021/3/9
Foreign DNA to be inserted
Agarrose gel
Nitrocellulose sheet
Transfer protein
Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody
Autoradiography
Autoradiogram Protein band detected by specific antibody
AmpliTaq FS dATP, dCTP, dGTP, dTTP
ddCTP
+
ddATP
ddGTP ddTTP
测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进 行纯化，除去过量的ddNTP后上样。
2021/3/9
27
三．基因文库与cDNA文库
1．基因文库（genomic library） cDNA文库（complemental DNA library）
•酶法 •化学法 •测序技术进展
2021/3/9
20
模板 3´ CCGGTAGCAACT 5´ 引物 5´ GG 3´
酶 法 序
dATPd
酶 反
CGTTPPddT+ddATP
应 TP
dATPd
CGTTPPddT+ddCTP
TP
dATPd
CGTTPPddT+ddGTP
TP
dATPd
CGTTPPddT+ddTTP
基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因 以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：
N=ln(1-p)/ln(1-f) N 基因文库所包含克隆的数目； p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99% ；
f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。
2021/3/9
3
植物冠瘿瘤
pBR322质粒的结构
2021/3/9
Ti质粒结构 4
太小不能被包装
DNA
用限制性内切酶 除去中间一段
与外源DNA连接
重组载体的体外包装
头部前体
多联体 COS DNA
COS
A蛋白 COS
带有外源DNA的 噬菌体
以噬菌体为载体进 行DNA克隆
2021/3/9
成熟的颗粒
在宿主细胞内进行 DNA的装配过程5
DNA测序的基本战略
设法产生带标记的不同长度的成套DNA片 段，各带有标记的片段起点相同、终点不同 ，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都 有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差 一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后 ，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA 片段就可读出待测DNA的碱基序列。
2 . 文库的Leabharlann Baidu建
2021/3/9
28
基因文库
基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的 分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部 基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以 备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其 为genomic library。
computer analysis
样品槽
2021/3/9
成象透镜 聚焦透镜
高灵敏度相机 旋光镜/棱镜组件
凝胶中DNA移动方向
输入光学系统
激光器
23
DNA的化学测序示意图
2021/3/9
反应试剂 G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸 T+C反应：肼 C反应：NaCl+肼
24
测序技术进展
同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳
TP
列 GGCCA GGCCATCGTTGA
分
GGC
GGCC GGCCATC
GGCCATCG GGCCATCGTTG
GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT
析
的
AC G T
原 理
GGCCATCGTTGA
电 GGCCATCGTTG
泳 GGCCATCGTT
方
GGCCATCGT
向
GGCCATCG
+
Joining
Plansmid vector
Recombinant DNA molecule
Introduction into host cells by transformation of viral infection
Host chromateme
Cloning
Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddATP (terminator)
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddCTP
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddGTP
SDS-Polyacrylamide 202g1e/3l /9
Polymer sheet
Autoradiogram
11
DNA重组技术的应用
(1) 开辟生物学研究的新纪元 •反向生物学（invese biology）的诞生
（2）促进生物技术产业的兴起 •基因药物 •基因诊断和治疗 •转基因动植物
2021/3/9
30
基因文库和cDNA文库的建立
与放射性标记 DNA探针杂交
2021/3/9
吸附有DNA 片段的膜
放射自显影
10
Southern和Western印迹法
DNA frangment
Electrophoresis
Transfer of DNA by blotting
32P-labled DNA probe
Autoradiography
工
程
2021/3/9
带有外源基因 的Ti质粒
Ti辅助DNA 给体质粒
宿主特 异性
Ti辅助DNA 给体质粒
Ti质粒转移并插 入植物DNA
植物DNA
14
第二节 蛋白质工程简介
在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋 白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往 并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提 出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进 行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展， 生物工程的重要组成部分。
GGCCATC
GGCCAT
GGCCA
GGCC
2021/3/9
GGC
3´
5´
A
T
G
C
T
A
T
A
读出模板 G 读出模板 C
互补序列 C 序列 G
T
A
A
T
C
G
C
G
5´
231´
5´ CTGACTTCGACAAAGAA
3´未知序列的单链DNA
TGTT 放射性标记的引物
DNA的 Sanger测
序法 (酶法)
Klenow酶 dNTP
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP
反应混合物
ddG ddG ddG ddG
较大片段
凝胶电泳 ACT G
2021/3/9 较小片段
读出模板 互补序列
3´
5´
G A C T G A A G C T G T T
读出待测 序列
C T G A C T T C G A C A A
5´
32´2
DNA的测序仪示意图
蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级 结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级 结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经 周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。
研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞 因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以 及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。
转化寄主细 胞
蛋白质
制备合成肽
制备对所编码蛋白 专一的抗体
测定出AA 顺序
合成cDNA 探针
用Southern印迹法 筛选DNA文库
蛋白质
2021/3/9
制备专一的抗体
沉淀核糖体 分离mRNA
基因或 c1D7 NA
第三节 核酸研究技术简介
一、DNA序列测定 二、基因文库与cDNA文库 三、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）
用NaOH菌体裂解 DNA变性
32P-cDNA
单链DNA结 合到膜上
杂交 放射自显影
原位杂交法筛选 DNA重组体图解
2021/3/9
与放射性cDNA杂
交的菌落的斑点
9
限制性酶切割 DNA分子
限制片段 琼脂糖电泳
Southern 印迹法
带有DNA片 段的凝胶
用缓冲液 转移DNA
转移至硝酸纤维素膜上
凝胶 滤膜
•2蛋021/白3/9 质技术和核酸技术的相互增强
15
生物酶工程示意图
遗传设计
酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案
2021/3/9
效用 发 展
产品
新酶 克隆酶 突变酶
DNA重组 技术
遗传修饰
DNA重组 技术
酶基因
16
蛋白质技术和核酸技术的相互增强
插入表达载 体
基因或 cDNA
推导出AA 顺序
为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库应 含的克隆数的计算公式如下：
N=ln(1-p)/ln(1-1/n)
N cDNA文库所包含克隆的数目；
p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%；
1/n 每一种低丰度的mRNA占总 mRNA的分数。
2021/3/9
12
胰岛素原的人工合成
胰脏
胰岛素原基因
胰岛素原
反转录酶
与质粒 连接
感染 E.coli
(A)n 胰岛素原mRNA
cDNA
重组质粒
mRNA
转化细菌
2021/3/9
13
I 二元载体系统
外源基因
Ti
质
Ti辅助质粒
粒
为
载
II 共整合载体
体
的
植
宿主特 异性
pBR型质粒（ 整合
给体质粒）
物
基
因
III T-DNA的转移与整合
同位素标记 平板电泳
ACG T
单色荧光标记 多色荧光标记 平板电泳 毛细管电泳
ACG T
测序图谱
T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T
2021/3/9
25
引物标记法测序(Dye Primer)
一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。
2021/3/9
2021/3/9
18
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的 开关按键来实现功能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图 ：
按
PCBA
键
开关 键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型， 尽量选择平头类的按键，以 防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计 间隙建议留0.05~0.1mm，以 防按键死键。
第十六章 基因工程和蛋白质工程简介
第一节 DNA重组与基因工程 第二节 蛋白质工程简介 第三节 核酸研究技术简介
2021/3/9
返回 1
第一节 DNA重组和基因工程
基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把 DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体 DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使 外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning， 克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物 原有的遗传性状。
噬菌体感染大肠杆菌的途径
2021/3/9
6
DNA重组体的筛选
• 载体特征的直接筛选 • 菌落的原位杂交 • 免疫学方法
2021/3/9
7
如果外源DNA插 入，氨卞青霉素 抗性基因失活
如果外源DNA插 入，四环素抗性基 因失活
pBR322质粒结构
2021/3/9
8
复印至硝酸 纤维素膜上
细菌菌落
反应结束后， 将4管反应液混 合，经乙醇沉淀 后上样
+ AmpliTaq FS enzyme dCTP, dATP, dGTP, dTTP ddTTP
26
终止法测序(Dye Terminator)
一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)
unlabeled primer template DNA
29
cDNA文库
真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外
显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使 编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加 工成熟的mRNA反转录成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表 达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有 一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都 通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被 克隆的总和称为cDNA文库。 RNA病毒的基因组是RNA，也必须将RNA先 转录成cDNA，再建立文库。
一、DNA重组的技术路线
二、基因工程的应用与前景
三、DNA体外重组常用的酶
2021/3/9
2
DNA重组的 技术路线
1、目的基因的制备 2、载体的构建 3、目的基因与载体 的重组 4、重组 体导入宿主 细胞进行扩增 5、克隆基因的鉴定
2021/3/9
Foreign DNA to be inserted
Agarrose gel
Nitrocellulose sheet
Transfer protein
Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody
Autoradiography
Autoradiogram Protein band detected by specific antibody
AmpliTaq FS dATP, dCTP, dGTP, dTTP
ddCTP
+
ddATP
ddGTP ddTTP
测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进 行纯化，除去过量的ddNTP后上样。
2021/3/9
27
三．基因文库与cDNA文库
1．基因文库（genomic library） cDNA文库（complemental DNA library）
•酶法 •化学法 •测序技术进展
2021/3/9
20
模板 3´ CCGGTAGCAACT 5´ 引物 5´ GG 3´
酶 法 序
dATPd
酶 反
CGTTPPddT+ddATP
应 TP
dATPd
CGTTPPddT+ddCTP
TP
dATPd
CGTTPPddT+ddGTP
TP
dATPd
CGTTPPddT+ddTTP
基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因 以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：
N=ln(1-p)/ln(1-f) N 基因文库所包含克隆的数目； p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99% ；
f 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。
2021/3/9
3
植物冠瘿瘤
pBR322质粒的结构
2021/3/9
Ti质粒结构 4
太小不能被包装
DNA
用限制性内切酶 除去中间一段
与外源DNA连接
重组载体的体外包装
头部前体
多联体 COS DNA
COS
A蛋白 COS
带有外源DNA的 噬菌体
以噬菌体为载体进 行DNA克隆
2021/3/9
成熟的颗粒
在宿主细胞内进行 DNA的装配过程5