抗荧光淬灭封片剂
DAPI-抗荧光淬灭封片剂
DAPI-抗荧光淬灭封片剂
产品编号：F-0045 规格：10ml
产品简介
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，它能与DNA结合，在紫外光下可观察到蓝色荧光，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm。
使用范围
本产品为即用型工作液，无须稀释，直接用于FISH、IF、TUNEL等细胞核的荧光染色。
储存条件
-20℃，避光
本产品需要严格避光，可放于铝饭盒中或用锡纸包裹。
本产品为淡黄色粘稠液体，由于其中的抗荧光淬灭成分会吸收光，使用时间长后，液体会慢慢变深，最终为变为深褐色时，请勿使用。
使用方法
FISH
杂交结束，标本经过洗液洗涤、再经梯度酒精脱水、干燥，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，室温下，大约20分钟后可观察荧光。
IF
孵育二抗结束，PBS洗涤后，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，避光，室温下，大约20分钟后可观察荧光。
注意：
本产品含有甘油、抗荧光淬灭剂，也具备封片作用，在细胞核染色后，无须清洗，可减缓荧光淬灭，在严格避光情况下，4℃保存一周，荧光仍不会淬灭。
相关产品
广州市外显子生物技术有限公司
广州市海珠区敦和路189号留学人员创业基地1栋308室
技术支持：QQ 2251645850 订购：QQ 1050304988
咨询：E-mail：focobio@; exonlab@; Tel: 86-020-********。
抗荧光淬灭剂的原理
抗荧光淬灭剂的原理抗荧光淬灭剂，这可是个挺有趣的东西呢！咱先得知道啥是荧光淬灭。
就好比一个小彩灯，本来亮堂堂的，突然被什么东西给捣乱了，一下子就暗下去了，这就是荧光淬灭啦。
那为啥会这样呢？有好多原因呢。
有时候是周围的环境里有一些调皮捣蛋的分子，它们像小坏蛋一样，把荧光分子的能量给抢走了，荧光分子没能量了，就不发光或者发光变弱了。
这时候抗荧光淬灭剂就闪亮登场啦。
它就像是荧光分子的小保镖一样。
这个小保镖很聪明哦，它会在荧光分子周围形成一种保护圈。
那些想捣蛋的分子靠近的时候，小保镖就会把它们拦住，不让它们去抢荧光分子的能量。
比如说，有些抗荧光淬灭剂就像一个个小盾牌，把荧光分子遮得严严实实的，那些坏分子就没办法下手啦。
还有些抗荧光淬灭剂呢，它们会和荧光分子手拉手，就像好朋友一样。
当有危险靠近的时候，它们就一起抵抗。
这种拉手可不是简单的拉手哦，它们在能量的传递上也有一套。
会让荧光分子的能量稳定住，不会轻易被抢走。
再说说这些抗荧光淬灭剂的神奇之处吧。
你想啊，在科学研究里，要是荧光分子老是淬灭，科学家们就没法好好观察那些微观的东西啦。
比如说在观察细胞里面的一些小结构的时候，就靠荧光分子来标记呢。
如果荧光淬灭了，就像在黑夜里突然没了手电筒一样，啥都看不到了。
而抗荧光淬灭剂就保证了这个手电筒一直亮着，让科学家们能顺利地进行研究。
在一些检测实验里也是一样的。
比如说检测一些疾病的标志物，如果荧光老是淬灭，那检测结果可能就不准啦。
抗荧光淬灭剂就像是一个稳定结果的小能手，让检测能够准确地进行。
其实抗荧光淬灭剂就像一个默默奉献的小英雄呢。
它没有那些特别耀眼的光环，但是它在幕后做的事情可重要啦。
它让那些荧光分子能够稳定地发光，为我们的科研、检测等好多方面都提供了大大的帮助。
如果没有它，很多关于荧光的应用可能都会变得一团糟呢。
所以呀，可别小看了这个抗荧光淬灭剂哦。
抗荧光淬灭封片液成分
抗荧光淬灭封片液成分
嘿，朋友们！今天咱来聊聊抗荧光淬灭封片液的成分。
你可别小看了这玩意儿，它就像是给我们的样本穿上了一层保护衣呢！
这抗荧光淬灭封片液里啊，通常有一些特别的成分。
就好像是一个团队里的各个成员，都有着自己独特的作用。
比如说，有一种成分就像是一个忠诚的卫士，努力维持着样本的稳定，让荧光信号能乖乖地待在那里，不轻易消失。
还有的成分呢，就如同一个神奇的魔法师，能够增强荧光的亮度和持久性，让我们能更清楚地看到那些细微之处。
你想想看，要是没有这些成分的精心呵护，我们观察的那些漂亮的荧光图像岂不是很快就会变得暗淡无光啦？那可就太可惜了呀！就好比你精心画了一幅美丽的画，结果没一会儿颜色就掉光了，那多让人沮丧啊！
而且啊，这些成分还得相互配合得恰到好处才行。
这就跟踢足球一样，每个球员都要在自己的位置上发挥好作用，同时和队友紧密配合，才能赢得比赛。
如果某个成分“掉链子”了，那整个封片液的效果可就大打折扣啦。
再打个比方，这抗荧光淬灭封片液的成分就像是一道美味菜肴里的各种调料。
盐不能太多，不然太咸；糖不能太少，不然没味道。
只有各种调料搭配得宜，才能做出让人赞不绝口的美食。
咱在使用抗荧光淬灭封片液的时候，可一定要选对产品，就像挑水果一样，得挑新鲜又甜美的。
不同的样本可能需要不同的封片液呢，这可得仔细着点儿。
要是选错了，那不就相当于给千里马套上了小毛驴的缰绳，能发挥好才怪呢！
总之，抗荧光淬灭封片液的成分可真是太重要啦！它们默默地守护着我们的样本，让我们能更好地探索微观世界的奥秘。
可别小瞧了它们哟！你说是不是呀？。
Hoechst 染色
本人收集的激光共聚焦常见荧光染料染色方法zuohy(2008-09-19 17:33:43)一、Hoechst 33258染色1、试剂盒组成固定液 50 mlHoechst 33258染色液 50 ml抗荧光淬灭封片液 5 ml说明书 1 份保存条件：4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。
本试剂盒自订购之日起六个月内有效。
2、注意事项：需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
需PBS或0.9%NaCl溶液。
需盖玻片与载玻片。
荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。
3、使用说明：1）贴壁细胞A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。
将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。
B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。
C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。
洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。
D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。
也宜用摇床，或手动晃动数次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。
使细胞接触封片液，切勿弄反。
G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。
激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。
2）悬浮细胞A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。
B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。
洗涤期间手动晃动。
C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤
细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤贴壁细胞免疫荧光法(1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min。
(2） 4%多聚甲醛固定细胞爬片15min。
(3） 1XPBS洗涤3 次，每次5min。
(4） 0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。
(5) 1×PBS 洗涤3 次，每次5min。
(6） 1%BSA室温封闭30min。
(7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
(8) 1 ×PBS 洗涤3 次，每次5min。
(9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。
(10) 1×PBS 洗涤3 次，每次5min。
(11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
(12）1×PBS洗涤3 次，每次5min。
(13）用抗荧光淬灭剂封片。
(14）荧光显微镜下观察采集图像。
悬浮细胞免疫荧光法（一)(1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
(2）离心吸去 PBS，4%多聚甲醛固定液，重悬细胞，置冰上固定30 min。
(3）离心、吸去固定液，用4℃ 1×PBS重悬细胞，离心800 g 离心5 min，去PBS，留细胞沉淀。
(4） 0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。
(5）离心800 g离心5 min，去通透液，留细胞沉淀。
▲注意:步骤（4）和(5）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤(6）使用1% BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
(7）离心800 g离心5 min，去封闭液，留细胞沉淀。
(8) 孵育一抗,浓度根据抗体说明书操作,4℃摇床孵育过夜(一般孵育15-16h)。
(9）用4℃ 1×PBS稀释细胞和抗体，离心，吸去PBS，以4℃ 1×PBS重悬细胞，重复1次。
抗荧光淬灭封片剂
抗荧光淬灭封片剂简介：抗荧光淬灭封片剂(Antifade Mounting Medium)又称抗荧光衰减封片剂(Fluorescence decay resistant Medium)，是一种用于减缓荧光淬灭的封固剂。
可以用于减缓各种常见荧光染料的荧光淬灭。
按每个样本需要封片剂计算，可以用于样本的封片。
组成：自备材料：1、 载玻片2、 盖玻片3、 荧光显微镜操作步骤(仅供参考)：1、贴壁细胞样本①染色完成后，吸去染色液。
②滴一滴Antifade Mounting Medium 于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。
③在荧光显微镜下观察。
2、组织切片①染色完成后，吸去染色液。
②滴一滴Antifade Mounting Medium 于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。
③在荧光显微镜下观察组织切片。
3、其它样品其它样品参考细胞样品或组织切片进行操作。
注意事项：1、 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
2、 在使用Antifade Mounting Medium 的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。
编号 名称 IH0252 IH0252 Storage Antifade Mounting Medium 5ml 10ml 4℃ 避光 使用说明书 1份3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
亦可短期内室温存储。
相关：编号名称DH0005Mayer苏木素染色液IH0091多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mg/ml)IH0142PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.2-7.4)IH0270甘油明胶封固液IH0305柠檬酸钠抗原修复液(50×)PW0053Western抗体洗脱液(碱性)TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)TC1213 总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP单试剂比色法)。
抗荧光衰减封片剂
抗荧光衰减封片剂Antifade Solution货号：P070011描述：在进行荧光显微镜观察时，用于对荧光组织和细胞样品的封片。
抗荧光衰减封片剂以高纯度甘油为介质，内含抗荧光淬灭剂，有强烈的抗荧光衰减作用。
样品封片后4℃或－20℃避光保存2-3周，可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光发光强度，同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。
适用于所有光谱范围的荧光如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。
包装与保存：5 ml或10 ml包装，每一24 x 24 mm盖玻片用约20-40µl。
自然温度运输，收到后－20℃避光保存至少1年。
4℃保存3月。
适用：对所有光谱范围的荧光均有抗衰减作用，如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。
适用于：1. 组织细胞免疫荧光组织化学染色样品封片；2. 染色体荧光观察封片；3. 核酸荧光原位杂交样品封片。
使用方法1.吸去载玻片上的液体，略微晾干残留液体。
2.取20-40µl封片剂滴加在载玻片样品处。
也可直接加到细胞培养孔内观察。
3.盖上盖玻片。
盖玻片规格为24 x 24 mm或24 x 60 mm大小。
4.轻轻压盖玻片，用滤纸小心吸除盖玻片周围多余液体，室温放置数分钟。
5.直接进行荧光显微镜观察。
片子4℃或－20℃避光保存2周荧光无明显衰减。
6.如需永久封片可用市售指甲油封固盖玻片周围，但通常这样做并无必要。
注意事项1.封片溶液成分无特殊毒性。
2.如盖玻片脱落或错位，可将玻片放入PBS中取出盖玻片，重新用封片剂封片。
3.也可将适量抗荧光衰减封片剂直接加到细胞培养孔内，进行荧光观察。
防止细胞荧光淬灭的方法
防止细胞荧光淬灭的方法
选择合适的荧光染料和荧光蛋白：使用与荧光显微镜的激发波长和发射波长相匹配的荧光染料和荧光蛋白进行细胞成像。
降低激发光的强度：尽可能降低激发光的强度，减少曝光时间。
避免长时间暴露：避免长时间将样品暴露在“无用”的光照条件下，例如在没有收集数据时在镜下长时间观察。
使用抗荧光淬灭封片剂：为尽量减少实验样品的光漂白，可以使用抗荧光淬灭封片剂，以提高活细胞和固定细胞样品中荧光染料的光稳定性。
使用荧光淬灭剂：荧光淬灭剂中的离子可通过碰撞方式，捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态和能量释放，从而淬灭自发荧光。
使用Evan’s蓝或者台盼蓝：可以采用0.001%或至0.1%浓度的Evan’s蓝或者台盼蓝染色，这种物质会均匀分布到组织或者细胞上，它能够结合不必要的固有荧光物质或背景性荧光物质，显著减少自发荧光。
免疫荧光双染完整版
免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
抗荧光淬灭封片剂配方
抗荧光淬灭封片剂配方一、简介抗荧光淬灭封片剂是一种用于荧光显微镜下观察细胞的试剂。
在荧光显微镜下，由于荧光分子的不可逆性猝灭作用，会导致样品中的荧光信号逐渐减弱或消失，影响观察效果。
抗荧光淬灭封片剂可以有效地减轻这种猝灭作用，提高样品中荧光信号的稳定性和持久性。
二、配方1. PVA（聚乙烯醇）：PVA是本试剂的主要成分之一，在封片剂中起到增稠、降低表面张力、防止气泡生成等作用。
常见的PVA型号有17-88和10-98两种，前者的粘度较低，后者较高。
2. Glycerol（甘油）：甘油是一种具有保湿性质的化合物，在本试剂中起到保持细胞膜完整性、减少蒸发和挥发等作用。
3. DABCO（1,4-二氨基环己烷）：DABCO是一种具有活性氮原子的化合物，在本试剂中起到抗荧光淬灭的作用。
它可以与氧气、水和其他有机分子形成复合物，从而减少荧光分子的不可逆性猝灭作用。
4. PBS（磷酸盐缓冲液）：PBS是一种缓冲液，可以调节试剂的pH 值，使其适合于细胞生长和显微镜观察。
5. DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吡啶）：DAPI是一种DNA染料，在本试剂中起到标记细胞核的作用。
它可以与DNA结合，发出蓝色荧光。
6. Mounting medium（封片剂）：封片剂是一种用于固定细胞和显微镜观察的介质。
常见的封片剂有DABCO、Vectashield等。
三、制备方法1. 加入PVA：将适量的PVA加入PBS中，并在50℃下搅拌至完全溶解。
2. 加入甘油：将适量的甘油加入PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。
3. 加入DABCO：将适量的DABCO加入甘油-PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。
4. 加入DAPI：将适量的DAPI加入甘油-PVA-DABCO溶液中，并搅拌至均匀混合。
5. 制备封片：将制备好的样品滴在载玻片上，加入适量的封片剂，然后用盖玻片覆盖。
最后用胶水固定盖玻片。
四、注意事项1. 避免过度搅拌：过度搅拌会使PVA分子链断裂，导致溶液黏度降低。
brdu组织切片免疫荧光染色步骤
brdu组织切片免疫荧光染色步骤BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA合成期（S期）代替胸腺嘧啶掺入到DNA中，常用于标记活细胞中新合成的DNA，以研究细胞的增殖和分化。
BrdU 组织切片的免疫荧光染色步骤大致如下：1.样本处理：将待检测的组织样本进行固定和切片。
固定通常使用4%的多聚甲醛，时间一般为30分钟到1小时，以确保组织中的蛋白质和其他成分得到妥善保存。
切片厚度通常为5-10μm，以便于后续的染色和观察。
2.DNA变性：由于BrdU已经掺入到DNA中，因此需要对DNA进行变性处理，使BrdU暴露出来，以便与抗体结合。
这一步通常使用2N的HCl进行处理，室温下变性30分钟，随后用0.1M的硼酸钠（pH 8.5）中和酸，再用PBS洗涤。
3.封闭和一抗孵育：在切片上滴加封闭液（如含5%BSA的PBS），以封闭非特异性结合位点，减少背景染色。
然后，滴加BrdU特异性抗体（一抗），在湿盒中4°C孵育过夜。
一抗的浓度和使用时间应根据实验条件和抗体说明书进行优化。
4.二抗孵育：次日，用PBS洗涤切片以去除未结合的一抗。
然后，滴加荧光标记的二抗（如CY-2或CY-3等），在避光条件下室温孵育1小时。
二抗的选择应与一抗的种属和荧光染料相匹配。
5.洗涤和封片：用PBS洗涤切片以去除未结合的二抗。
然后，用抗荧光淬灭封片剂进行封片，以防止荧光染料的淬灭和样本的干燥。
封片后，可以在荧光显微镜下观察切片。
6.观察和分析：在荧光显微镜下观察切片，可以看到BrdU阳性细胞发出明亮的荧光信号。
可以通过计数阳性细胞的数量或测量荧光信号的强度来定量分析细胞的增殖情况。
同时，还可以结合其他染色方法（如DAPI染色）来观察细胞核的形态和数量。
需要注意的是，在进行BrdU免疫荧光染色时，应设置阳性和阴性对照实验，以验证实验结果的可靠性。
此外，实验过程中应避免强光照射和长时间暴露于空气中，以防止荧光染料的淬灭和样本的干燥。
抗荧光衰减封片剂(含 DAPI)使用说明
抗荧光衰减封片剂（含DAPI）使用说明货号：S2110规格：5ml/25ml保存：-20℃保存，一年有效。
产品简介：抗荧光衰减封片剂是一种用于减缓荧光衰减的封片试剂。
以甘油为基础，加入抗荧光衰减剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。
封片后，样品4℃或者-20℃避光可保存2-3周。
本试剂操作简单，在封片时用移液枪滴一滴抗荧光衰减封片液，盖上盖玻片就可以了。
抗荧光衰减封片剂内含DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。
因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞。
DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为360nm，最大发射波长为460nm。
使用说明：使用前平衡至室温。
1.贴壁细胞样品：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
2.组织切片：A.染色完毕后，吸尽液体。
B.滴一滴(20-50ul)抗荧光衰减封片液于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。
C.随后即可通过荧光显微镜观察样品。
3.其它样品：其它样品参考细胞样品或组织切片进行操作。
注意事项：1.荧光物质均易发生衰减，染色后的样品宜避光保存。
2.在使用抗衰减封片液的情况下可以减缓衰减，但仍宜尽量避光和尽早拍照。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
相关试剂：P11128%多聚甲醛P11104%多聚甲醛P210010×多聚赖氨酸A1840荧光抗体稀释液SF8羊抗兔IgG-FITC。
免疫荧光步骤
免疫荧光步骤
1.脱蜡和水化
脱蜡前,应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min;1组织芯片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯后再浸泡10min；2无水乙醇中浸泡5min；395%乙醇中浸泡5min；470%乙醇中浸泡5min；动作要快,减少暴露在空气中中的时间2.PBS洗两次各5min;
整个过程中注意切片不能干
3.抗原修复,用于多聚甲醛固定的石蜡包埋组织芯片;煮沸热修复电炉或者水浴锅加热 0.01M柠檬酸钠缓冲溶液pH6.0至95℃左右,放入组织芯片加热10min,必须等缓冲液冷却后,方能将切片取出;
4.PBS洗3次每次5min;
5.滴加5%正常山羊血清,室温封闭30min,甩去多余液体;
6.滴加一抗根据说明书的比例稀释,一般为1:100,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时4℃过夜后在37℃复温45min;
7.PBS洗3次每次5min;
8.滴加荧光标记的二抗,室温避光孵育1h;注意抗体针对的种属,使用浓度,用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光;
9.PBS洗3次每次5min;
10.DAPI染色：把DAPI滴在片上,将切片覆盖,50ul/片,染色10min;
11.PBS洗3次每次2min;
12.封片：抗荧光淬灭封片剂封片,再拍照;。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)说明书
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)说明书货号：CA1040规格：25T/50T保存：-20℃保存，FITC-dUTP需避光保存。
如果频繁使用（一周内），5×Reaction Buffer，FITC-dUTP和抗荧光淬灭封片剂可2-8℃保存。
产品简介：一步法TUNEL细胞凋亡检测是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。
对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到凋亡细胞。
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以观察到180-200bp的DNA ladder。
基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT--mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。
在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。
在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。
产品内容：试剂名称包装包装TdT酶25μl50μlFITC-dUTP25μl50μl5×Reaction Buffer400μl2×400μl抗荧光淬灭封片剂 2.5ml5ml说明书1份1份注意事项：用户需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS，用于固定的4%多聚甲醛，同时需自备含0.1%Triton X-100的PBS。
细胞免疫荧光染色操作步骤
细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。
实验步骤如下：1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。
3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。
4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。
6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。
7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。
次日：8.取出细胞复温至室温约1h。
9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS配制。
浓度1:20011.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。
12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。
14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。
16.上机confocol建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020细胞免疫荧光步骤【原理】用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物由于荧光素在荧光显微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光，借此可对抗原定位和定量。
【材料】培养细胞【试剂】①4%的多聚甲醛。
②PBSPH≌：NaCl18克，克，NaH2PO4,2H20克溶于2000m蒸馏水。
③封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。
④第一抗体：xxx。
⑤第二抗体：与一抗种属性匹配TRITC标记的，（中杉金桥公司，ZF-0313GoatAnti-MouseIgG(H+L),）。
⑥DAPI：（碧云天公司，）染核。
⑦抗荧光淬灭封片剂:碧云天公司【器材】冰箱，载玻片，盖玻片（做正面标记），微量移液枪，移液枪枪头，吸管，湿盒，指甲油，DOCK笔，EP管，吸水纸，六孔板，摇床，振荡器。
【配制液体等】①%-Triton：(PBS+由于Triton比较粘，配前先在室温放会儿,磁力搅拌器搅匀可分装储存)②10%正常封闭血清：(用PBS-Triton稀释，振荡器上振荡充分混匀，临用前配制)。
③%-Tween；用PBS稀释Tween。
【步骤】1取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记)。
2每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定14分钟。
注意，要水平，覆盖均匀。
（准备封闭血清用PBS-Triton稀释1:10振荡器上振荡混匀）。
3冷PBS,5分钟X2次摇床150rpm缓慢洗净，PBS-Triton透膜5min。
（如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜）4擦干爬片边缘，用DOCK笔在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所加试剂因失去张力流失，导致干片）。
抗荧光淬灭封片剂配方
抗荧光淬灭封片剂配方一、引言在生物荧光显微镜技术中，荧光淬灭是一个非常重要的问题。
荧光淬灭指的是在激发荧光标记的样品时，标记的荧光会随着时间的推移逐渐减弱甚至消失。
这一现象常常会干扰实验结果的观察和分析。
为了解决荧光淬灭问题，研究人员通常会使用抗荧光淬灭封片剂来抑制荧光的淬灭，使得荧光信号能够更稳定和持久地显示。
本文将围绕抗荧光淬灭封片剂配方展开探讨，介绍常用的配方组分及相关考虑。
二、抗荧光淬灭封片剂配方的组成抗荧光淬灭封片剂的配方通常包含以下几个关键组分：1. 缓冲液缓冲液在抗荧光淬灭封片剂中扮演着重要的角色。
合适的缓冲液可以维持溶液的酸碱平衡，稳定荧光标记物并减少荧光淬灭的发生。
常见的缓冲液组分包括：•Tris（三羟甲基氨基甲烷）：用作缓冲剂并维持溶液的pH值稳定。
•磷酸盐缓冲液：常用的生物学实验缓冲液，能够提供稳定的pH值。
2. 荧光稳定剂荧光稳定剂是抗荧光淬灭封片剂中的关键组分，能够减缓或阻止荧光淬灭的发生。
它们可以与氧气或其他荧光淬灭因素发生反应，从而维持荧光信号的稳定性和持久性。
常见的荧光稳定剂包括：•溴化物盐：例如溴化钾、溴化钠等，能够减缓氧气对荧光的影响并提高荧光信号的持久性。
•抗氧化剂：例如丙酮酸、谷胱甘肽等，可以抑制氧气对荧光信号的淬灭。
3. 抗褪色剂抗褪色剂也是抗荧光淬灭封片剂的重要组成部分，它们能够保护荧光标记物免受光照引起的褪色和淬灭。
常见的抗褪色剂包括：•糖：例如蔗糖、葡萄糖等，能够降低光照对荧光淬灭的影响。
•抗氧化剂：例如硫代硫酸盐、联胺等，可以减少光照引起的褪色。
4. 抑制剂某些情况下，样品中的某些成分会对荧光信号产生干扰，因此需要加入适当的抑制剂来消除干扰。
常见的抑制剂包括：•胺基甲酸酯类物质：例如二乙氨基乙酸酯（DEAE）、甲基硫醇（MEA）等，可以抑制非特异性背景信号。
三、抗荧光淬灭封片剂配方的考虑因素在选择和设计抗荧光淬灭封片剂配方时，需要考虑以下几个因素：1. 样品特性不同的样品可能对荧光淬灭存在不同的敏感性和特性。
细胞免疫荧光详细步骤
细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。
细胞免疫荧光步骤
方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。
5.接下来二抗孵育步骤同上。
6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7.抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
抗荧光淬灭封片剂
简介：
抗荧光淬灭封片剂(Antifade Mounting Medium)又称抗荧光衰减封片剂(Fluorescence decay resistant Medium)，是一种用于减缓荧光淬灭的封固剂。
可以用于减缓各种常见荧光染料的荧光淬灭。
按每个样本需要封片剂计算，可以用于样本的封片。
组成：
自备材料：
1、 载玻片
2、 盖玻片
3、 荧光显微镜
操作步骤(仅供参考)：
1、贴壁细胞样本
①染色完成后，吸去染色液。
②滴一滴Antifade Mounting Medium 于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。
③在荧光显微镜下观察。
2、组织切片
①染色完成后，吸去染色液。
②滴一滴Antifade Mounting Medium 于组织切片上，盖上盖玻片，让切片接触封片液，尽量避免气泡。
③在荧光显微镜下观察组织切片。
3、其它样品
其它样品参考细胞样品或组织切片进行操作。
注意事项：
1、 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
2、 在使用Antifade Mounting Medium 的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。
编号 名称 IH0252 IH0252 Storage Antifade Mounting Medium 5ml 10ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
亦可短期内室温存储。
相关：
编号名称
DH0005Mayer苏木素染色液
IH0091多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mg/ml)
IH0142PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.2-7.4)
IH0270甘油明胶封固液
IH0305柠檬酸钠抗原修复液(50×)
PW0053Western抗体洗脱液(碱性)
TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)
TC1213 总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP单试剂比色法)。