液态活检技术在肿瘤诊治中的应用 马飞
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30
CTC的异质性
2015/10/26
Clinical Chemistry59:1 (2013)
乳腺癌CTC中存在不同分型，并与预后评价相关
12.7% 3.3% 2.7%
Yu M et al., Science , 2013, 339: 580-584.
乳腺癌CTC分型与治疗效果相关
Yu M et al., Science , 2013, 339: 580-584.
IPASS人群
吉非替尼
腺癌 不或少吸烟
43% 5.7月 18.8月
中国注册临床 吉非替尼 东方非选择人群
27% 3.3月 10月
TORCH 厄洛替尼 西方非选择人群
NA 2.2月 8.5月
对初治患者进行EGFR突变检测
英国NICE和ASCO指南推荐对所有新诊断的局部晚期或转移 的非小细胞肺癌进行EGFR基因检测
பைடு நூலகம்Voltaire ( 1694-1778 )
医生是这样的人们：他们处方一些 略有所知的药物，用在他们毫无所 知的人类上，以医治他们几乎不懂 的疾病。
量体裁衣
因材施教
肿瘤生物学特征
分子 遗传学表型的改变
细胞 恶性增殖与无控生长
宏观 侵袭性生长与转移
靶向治疗
放疗
化疗 手术
侵袭与转移
微环境改变
分
*Nature.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients.2011.
癌症患者ctDNA变异频率分布
变异ctDNA片段比例为： II/III期 (n=5)平均8.39%，中位8.36% IV期(n=43) 平均21.81%，中位12.04% 41.6%样本频率＞10%，10.4%样本频率＞50%
高通量测序技术的两大突破
通量：多个数量级提高
成本：多个数量级降低
第一代测序 1990年，人类基因组计划 6个国家，历时10年 >1000名科学家 30亿美元
高通量测序 一台最新的高通量的测序仪， 每天的数据产出相当于6-12个30X的人 类全基因组； 测序部分费用最低可以到10000RMB
ctDNA测序技术已经成熟
单细胞测序助力CTC研究
• 来自同一个病人的不同CTC都 展现出高度一致的全基因组拷 贝数变化模式,和同一病人的 转移灶肿瘤组织的拷贝数变化 模式一致
• 小细胞肺癌CTC的拷贝数变化 模式与肺腺癌CTC明显不同,展 现出一定的特异性
• 为将来基于CTC拷贝数变异来 进行癌症病人诊断提供了理论 基础
– 2004年 乳腺癌 NEJM – 2007年 结直肠癌 JCO – 2008年 前列腺癌 CCR – 2012年 CFDA批准
游离CTCs可辅助肺癌的TNM分期
CTC提高TNM辅助分期准确性，有望成为指导治疗和判断预后的敏感指标
Clin Cancer Res. 2009 Nov 15;15(22):6980-6.
ASCO Annual Report : 2015 临床肿瘤学进展
实时监测液态活检样本之 CTCs & ctDNA
循环肿瘤细胞
• 循环肿瘤细胞（CTC）
– 进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡 – 只有极少数具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下
来，并在一定条件下发展为转移灶
• CellSearch技术（强生公司）
% 患者提供肿瘤标本的平均比例
患者数 (N)
1000
500 21% 23%
25%
30%
22%
26%
0
INTACT I-II TRIBUTE TALENT
BR.21
ISEL INTEREST JC Soria, ASCO 2008
原发灶与转移灶存在生物学行为差异
Breast tumor Lung metastasis Liver metastasis
CTC用于检测ALK重排
J Clin Oncol 2013;31:2273-81.
CTC用于检测ALK重排
J Clin Oncol 2013;31:2273-81.
CTC中HR受体状态的检测
• KYRO:CTC总数139个，其中上皮型55个，混合型35个，间质型4个 • 原发灶HR状态为ER/PR（-） • 转移后CTC中表达HR情况如下所示：
Immunohistochemical staining of ER, PR, and HER2, respectively (×100)
液态活检的临床需求
Breast Cancer：N Engl J Med 351:781-791,2004 Prostate Cancer : Lancet Oncol 10:233-239, 2009 Colorectal Cancer: J Clin Oncol 26:3213-3221, 2008
在测序深度达到10000X,对于0.1%以上突变,检测灵敏度99%，特异性99%。
1965 1966 1967 1968 1969 1970 1971 1972 1973 1974 1975 1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015（1-4）
全国临床基因扩增检验实验室质量保证大会暨高通量测序技术临床应用高峰论坛·重庆
液态活检技术在肿瘤诊治中的应用
马飞 国家癌症中心 中国医学科学院肿瘤医院
我们曾经被这样评价……
Doctors are men who prescribe medicines of which they know
little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing.
子
靶
无控生长
向
治
恶性增殖
疗
遗传表型的改变
21世纪肿瘤防控策略
“寻找与破坏”
“靶向与控制”
（Seek & Destroy） （Target & Control）
Pro. Eschenbach （NCI）
A “smart” bomb & A “cluster” bomb
Dr. Nevin Murray
PNAS 2013 ;110(52):21083-8
液态活检：ctDNA
ctDNA被称为下一代癌症指标
乳腺癌甲基化
肺癌KRAS 黑色素瘤BRAF
结直肠癌KRAS 肝癌/卵巢癌TP53
胰腺癌KRAS 乳腺癌TP53
•1948年首次描述了游离核酸存在于人的血液中，但在肿瘤领域并未引起关注； •1994年癌症患者血液中检测到重要癌基因RAS变异，ctDNA的重要性得到关注； •相比于传统组织活检，ctDNA得到的是准确反映癌症演化过程的动态信息； •近十几年关于ctDNA的研究逐渐成为肿瘤相关研究的热点，被称为下一代癌症指标。
Lynch et al 2004
疗效差异带来了思考
精准医疗的探索开始于优势人群的经验： 亚裔、非吸烟、女性、腺癌……
Environment
Disease
Genetics
优势人群的机制：EGFR突变
(N=2880)
Mitsudomi et al., Cancer science 2007
不同人群不同的EGFR基因突变率
J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63.
CTC 检测EGFR与实时个体化治疗
N Engl J Med 2008;359:366-77.
25
CTC检测肺癌EGFR突变
灵敏度：96%；特异度：100%
N Engl J Med 2008;359:366-77.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
上皮型
混合型
间质型
高表达 中表达 低表达 无表达
红点：上皮型标志物 绿点：间质型标志物 紫点：ER/PR
CTC中HER2受体状态的检测
HER2基因扩增阳性CTC
HER2基因扩增阴性CTC
发现： 1、CTC HER2/CEP17比值低于组织样本 2、CTC中高多体现象较常见
欧洲专家研讨会建议至少所有腺癌患者，和/或非吸烟患 者应进行检测
Journal of Thoracic Oncology Volume 5, Number 10, October 2010
肿瘤组织的可获得性影响了突变检测
2500 2000 1500
入组患者 (N) 可进行EGFR突变分析肿瘤标本 可进行EGFR扩增分析肿瘤标本
“We have never been in a better position to advance cancer treatment… we know how to
personalize therapy to the unique genetics
of the tumor and the patient.” — Richard L Schilsky, M.D. Former
在测序深度达到1000X,对于1%以 上突变,检测灵敏度99%，特异性 99%
在测序深度达到10000X,对于0.1% 以上突变,检测灵敏度99%，特异 性99%
ctDNA研究进展情况
circulating tumor DNA publications （from pubmed）
350 300 250 200 150 100 50 0
President,ASCO.
“我们正处于一种前所未有的有利位置来推动癌症治 疗……我们知道如何根据患者和肿瘤独特的遗传特征将 治疗方式个体化。”
— 美国临床肿瘤协会前任主席 Richard L Schilsky.
精准医疗时代：方向决定了结果
美国总统奥巴马·2015
吉非替尼治疗肺癌显著的疗效
6 weeks gefitinib
乳腺癌CTC分型与病情进展相关
Yu M et al., Science , 2013, 339: 580-584.
单细胞精确操纵与基因组测序平台的建立
单细胞DNA 或RNA
单细胞全外显子组、
单 转录组测序：CG测序 细 胞 测 序 数据整合分析： 分 CGA™ Tools等 析
转移相关标志谱
原位PCR扩增 DNB文库制备
基线CTC数量与无进展生存和总生存的关系
所有非小细胞 肺癌病人
所有Ⅳ期非小 细胞肺癌病人
基线CTC数量<5的患者无进展生存期和总生存期明显高于基线CTC数量≥5的患者
J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63.
化疗前后CTC数量与无进展生存和总生存的关系
•化疗后CTC<5的患者无进展生存期和总生存期明显高于CTC>5的患者 •化疗前后CTC数量都<5 的患者无进展生存期和总生存期明显高于只有 一次测出CTC数量<5的患者
ctDNA用于监测复发
Reinert T, et al. Gut 2015;0:1–10. doi:10.1136
监测复发早于临床进展
在B细胞淋巴瘤患者中，ctDNA 判断复发平均早于CT 3.5月
Lancet Oncol Published Online April 2, 2015 http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(15)70106-3
西方非选择 人群
不
东方非选
同
择人群
人
群
亚裔非吸
烟腺癌
EGFR M+
10~15%
EGFR
35%
基
因
突
变
60%
率
%
100%
不同亚群EGFR-TKI的疗效明显不同
EGFR基因突 100%
59.7%
35%
变率%
10~15%
药物 人群
ORR PFS OS
NEJ002人群 吉非替尼 EGFR M+
73.7% 10.8月 30.5月
ctDNA在血浆中的比例： 早期 0.01% 中晚期>1%
*Expert Opin. Biol. Ther. The importance of examining the proportion of circulating DNA originating from tumor, microenvironment and normal cells in colorectal cancer patients. 2012. *Science. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. 2014.
CTC的异质性
2015/10/26
Clinical Chemistry59:1 (2013)
乳腺癌CTC中存在不同分型，并与预后评价相关
12.7% 3.3% 2.7%
Yu M et al., Science , 2013, 339: 580-584.
乳腺癌CTC分型与治疗效果相关
Yu M et al., Science , 2013, 339: 580-584.
IPASS人群
吉非替尼
腺癌 不或少吸烟
43% 5.7月 18.8月
中国注册临床 吉非替尼 东方非选择人群
27% 3.3月 10月
TORCH 厄洛替尼 西方非选择人群
NA 2.2月 8.5月
对初治患者进行EGFR突变检测
英国NICE和ASCO指南推荐对所有新诊断的局部晚期或转移 的非小细胞肺癌进行EGFR基因检测
பைடு நூலகம்Voltaire ( 1694-1778 )
医生是这样的人们：他们处方一些 略有所知的药物，用在他们毫无所 知的人类上，以医治他们几乎不懂 的疾病。
量体裁衣
因材施教
肿瘤生物学特征
分子 遗传学表型的改变
细胞 恶性增殖与无控生长
宏观 侵袭性生长与转移
靶向治疗
放疗
化疗 手术
侵袭与转移
微环境改变
分
*Nature.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients.2011.
癌症患者ctDNA变异频率分布
变异ctDNA片段比例为： II/III期 (n=5)平均8.39%，中位8.36% IV期(n=43) 平均21.81%，中位12.04% 41.6%样本频率＞10%，10.4%样本频率＞50%
高通量测序技术的两大突破
通量：多个数量级提高
成本：多个数量级降低
第一代测序 1990年，人类基因组计划 6个国家，历时10年 >1000名科学家 30亿美元
高通量测序 一台最新的高通量的测序仪， 每天的数据产出相当于6-12个30X的人 类全基因组； 测序部分费用最低可以到10000RMB
ctDNA测序技术已经成熟
单细胞测序助力CTC研究
• 来自同一个病人的不同CTC都 展现出高度一致的全基因组拷 贝数变化模式,和同一病人的 转移灶肿瘤组织的拷贝数变化 模式一致
• 小细胞肺癌CTC的拷贝数变化 模式与肺腺癌CTC明显不同,展 现出一定的特异性
• 为将来基于CTC拷贝数变异来 进行癌症病人诊断提供了理论 基础
– 2004年 乳腺癌 NEJM – 2007年 结直肠癌 JCO – 2008年 前列腺癌 CCR – 2012年 CFDA批准
游离CTCs可辅助肺癌的TNM分期
CTC提高TNM辅助分期准确性，有望成为指导治疗和判断预后的敏感指标
Clin Cancer Res. 2009 Nov 15;15(22):6980-6.
ASCO Annual Report : 2015 临床肿瘤学进展
实时监测液态活检样本之 CTCs & ctDNA
循环肿瘤细胞
• 循环肿瘤细胞（CTC）
– 进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡 – 只有极少数具有高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下
来，并在一定条件下发展为转移灶
• CellSearch技术（强生公司）
% 患者提供肿瘤标本的平均比例
患者数 (N)
1000
500 21% 23%
25%
30%
22%
26%
0
INTACT I-II TRIBUTE TALENT
BR.21
ISEL INTEREST JC Soria, ASCO 2008
原发灶与转移灶存在生物学行为差异
Breast tumor Lung metastasis Liver metastasis
CTC用于检测ALK重排
J Clin Oncol 2013;31:2273-81.
CTC用于检测ALK重排
J Clin Oncol 2013;31:2273-81.
CTC中HR受体状态的检测
• KYRO:CTC总数139个，其中上皮型55个，混合型35个，间质型4个 • 原发灶HR状态为ER/PR（-） • 转移后CTC中表达HR情况如下所示：
Immunohistochemical staining of ER, PR, and HER2, respectively (×100)
液态活检的临床需求
Breast Cancer：N Engl J Med 351:781-791,2004 Prostate Cancer : Lancet Oncol 10:233-239, 2009 Colorectal Cancer: J Clin Oncol 26:3213-3221, 2008
在测序深度达到10000X,对于0.1%以上突变,检测灵敏度99%，特异性99%。
1965 1966 1967 1968 1969 1970 1971 1972 1973 1974 1975 1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015（1-4）
全国临床基因扩增检验实验室质量保证大会暨高通量测序技术临床应用高峰论坛·重庆
液态活检技术在肿瘤诊治中的应用
马飞 国家癌症中心 中国医学科学院肿瘤医院
我们曾经被这样评价……
Doctors are men who prescribe medicines of which they know
little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing.
子
靶
无控生长
向
治
恶性增殖
疗
遗传表型的改变
21世纪肿瘤防控策略
“寻找与破坏”
“靶向与控制”
（Seek & Destroy） （Target & Control）
Pro. Eschenbach （NCI）
A “smart” bomb & A “cluster” bomb
Dr. Nevin Murray
PNAS 2013 ;110(52):21083-8
液态活检：ctDNA
ctDNA被称为下一代癌症指标
乳腺癌甲基化
肺癌KRAS 黑色素瘤BRAF
结直肠癌KRAS 肝癌/卵巢癌TP53
胰腺癌KRAS 乳腺癌TP53
•1948年首次描述了游离核酸存在于人的血液中，但在肿瘤领域并未引起关注； •1994年癌症患者血液中检测到重要癌基因RAS变异，ctDNA的重要性得到关注； •相比于传统组织活检，ctDNA得到的是准确反映癌症演化过程的动态信息； •近十几年关于ctDNA的研究逐渐成为肿瘤相关研究的热点，被称为下一代癌症指标。
Lynch et al 2004
疗效差异带来了思考
精准医疗的探索开始于优势人群的经验： 亚裔、非吸烟、女性、腺癌……
Environment
Disease
Genetics
优势人群的机制：EGFR突变
(N=2880)
Mitsudomi et al., Cancer science 2007
不同人群不同的EGFR基因突变率
J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63.
CTC 检测EGFR与实时个体化治疗
N Engl J Med 2008;359:366-77.
25
CTC检测肺癌EGFR突变
灵敏度：96%；特异度：100%
N Engl J Med 2008;359:366-77.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
上皮型
混合型
间质型
高表达 中表达 低表达 无表达
红点：上皮型标志物 绿点：间质型标志物 紫点：ER/PR
CTC中HER2受体状态的检测
HER2基因扩增阳性CTC
HER2基因扩增阴性CTC
发现： 1、CTC HER2/CEP17比值低于组织样本 2、CTC中高多体现象较常见
欧洲专家研讨会建议至少所有腺癌患者，和/或非吸烟患 者应进行检测
Journal of Thoracic Oncology Volume 5, Number 10, October 2010
肿瘤组织的可获得性影响了突变检测
2500 2000 1500
入组患者 (N) 可进行EGFR突变分析肿瘤标本 可进行EGFR扩增分析肿瘤标本
“We have never been in a better position to advance cancer treatment… we know how to
personalize therapy to the unique genetics
of the tumor and the patient.” — Richard L Schilsky, M.D. Former
在测序深度达到1000X,对于1%以 上突变,检测灵敏度99%，特异性 99%
在测序深度达到10000X,对于0.1% 以上突变,检测灵敏度99%，特异 性99%
ctDNA研究进展情况
circulating tumor DNA publications （from pubmed）
350 300 250 200 150 100 50 0
President,ASCO.
“我们正处于一种前所未有的有利位置来推动癌症治 疗……我们知道如何根据患者和肿瘤独特的遗传特征将 治疗方式个体化。”
— 美国临床肿瘤协会前任主席 Richard L Schilsky.
精准医疗时代：方向决定了结果
美国总统奥巴马·2015
吉非替尼治疗肺癌显著的疗效
6 weeks gefitinib
乳腺癌CTC分型与病情进展相关
Yu M et al., Science , 2013, 339: 580-584.
单细胞精确操纵与基因组测序平台的建立
单细胞DNA 或RNA
单细胞全外显子组、
单 转录组测序：CG测序 细 胞 测 序 数据整合分析： 分 CGA™ Tools等 析
转移相关标志谱
原位PCR扩增 DNB文库制备
基线CTC数量与无进展生存和总生存的关系
所有非小细胞 肺癌病人
所有Ⅳ期非小 细胞肺癌病人
基线CTC数量<5的患者无进展生存期和总生存期明显高于基线CTC数量≥5的患者
J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63.
化疗前后CTC数量与无进展生存和总生存的关系
•化疗后CTC<5的患者无进展生存期和总生存期明显高于CTC>5的患者 •化疗前后CTC数量都<5 的患者无进展生存期和总生存期明显高于只有 一次测出CTC数量<5的患者
ctDNA用于监测复发
Reinert T, et al. Gut 2015;0:1–10. doi:10.1136
监测复发早于临床进展
在B细胞淋巴瘤患者中，ctDNA 判断复发平均早于CT 3.5月
Lancet Oncol Published Online April 2, 2015 http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(15)70106-3
西方非选择 人群
不
东方非选
同
择人群
人
群
亚裔非吸
烟腺癌
EGFR M+
10~15%
EGFR
35%
基
因
突
变
60%
率
%
100%
不同亚群EGFR-TKI的疗效明显不同
EGFR基因突 100%
59.7%
35%
变率%
10~15%
药物 人群
ORR PFS OS
NEJ002人群 吉非替尼 EGFR M+
73.7% 10.8月 30.5月
ctDNA在血浆中的比例： 早期 0.01% 中晚期>1%
*Expert Opin. Biol. Ther. The importance of examining the proportion of circulating DNA originating from tumor, microenvironment and normal cells in colorectal cancer patients. 2012. *Science. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. 2014.