离子交换色谱法标准操作程序

方法摘要：
离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC）以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。

当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。

溶液pH低于C产品组分等电点PI时，组分带正电荷，可以跟固定相上的阳离子交换，吸附在固定相上，用盐浓度梯度洗脱时，组分按照表面正电荷从少到多的顺序被洗脱下来。

紫外检测器检测280nm处的响应值，根据组分峰面积计算纯度。

范围：
适用于本公司生产出的C产品的中间产品、原液、成品及稳定性样品的电荷异质性分析。

职责：
操作人员：
➢严格按照此规程要求进行操作。

岗位主管：
➢起草文件，并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；
➢监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；
➢培训，确保此操作规程的正确实施。

程序：
1术语解释
无
2试剂和材料
➢色谱柱：阳离子交换色谱柱，例如MabPac TM SCX-10，4.0×250mm，10µm（Thermo）➢试剂：N-（2-乙酰胺基）-2-氨基乙磺酸（ACES，分析纯），氯化钠（NaCl，色谱纯），盐酸（HCl，分析纯），磷酸氢二钠（Na2HPO4，色谱纯），磷酸（H3PO4，色谱纯），纯
化水（自制）
➢滤膜：孔径为0.45µm或以下
注：所用试剂可被同等或更高级别的试剂替代，但应证明适用；所有材料遵循厂家有效期。

3仪器设备
➢液相色谱仪：例如Agilent 1260
➢天平，精确到mg
➢pH计
➢溶剂过滤装置
➢离心机（转速10000 rpm以上）
➢移液器（10-1000 µl）
4溶液配制
4.1流动相配制
4.1.1流动相A：20 mM ACES，pH 6.20
称取ACES 3.64 g，加入1000 ml 水搅拌至完全溶解，HCl调pH 6.20±0.02；
经0.45 μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。

4.1.2流动相B：20 mM ACES，500 mM NaCl，pH 6.20
称取ACES 3.64 g，NaCl 29.22 g，加入1000 ml水搅拌至完全溶解，HCl调pH 6.20±0.02；
经0.45 μm滤膜过滤，室温保存，有效期3天，使用前超声脱气15min。

注：流动相调pH时，确认溶液温度在23~27℃。

4.1.3色谱柱保存液：20 mM Na2HPO4/H3PO4，pH 6.5
称量2.84 g Na2HPO4，加入1000 ml纯水搅拌溶解，用H3PO4调节pH值为6.50±0.02，使用0.45 μm滤膜过滤后，2-8℃低温保存，有效期1个月。

4.2 样品溶液配制
4.2.1参比品溶液配制
取规定的参比品，根据蛋白浓度标示量，用制剂缓冲液稀释至5.0 mg/ml，转移到样品
瓶。

例：参比品CDS20180209，蛋白标示量为22.0 mg/ml，稀释4.4倍（40 µl参比品+136µl
制剂缓冲液），稀释后浓度为5.0 mg/ml。

4.2.2供试品溶液配制
稀释方法同4.2.1。

对于浑浊的样品，需经0.22 μm的滤膜过滤，或者10000 rpm离心10min，取上清液至
样品瓶。

5检测方法
5.1色谱系统准备
5.1.1打开sealwash（清洗液：10%异丙醇-水溶液）；更换洗针瓶（清洗液：水）；
5.1.2以检测方法的流动相起始比例（流动相A：4%，流动相B：96%），1.0 ml/min的流速平
衡至基线平稳，至少20min。

5.1.3关键色谱参数和洗脱梯度
5.2进样序列
注：* 每检测10个供试品，需进参比品1次以确定系统适应性。

5.3色谱柱清洗和保存
序列运行结束，用100%流动相B以0.5 ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分钟；用流动相A和流动相B（92:8）以0.5ml/min的流速冲洗色谱柱不少于30分钟，色谱柱保存在流动相A和流动相B（92:8）中。

若色谱柱需保存超过1周，保存在色谱柱保存液中。

6数据分析及报告
6.1典型色图谱及色谱峰定义
典型的C产品的HPLC色谱图应有五个显著的主峰。

主峰区前的峰组为酸区，主峰之后的峰组为碱区。

C产品的HPLC典型图谱和色谱峰定义见图1。

图1 C 产品的HPLC 典型图谱
6.2 积分
基线撇去方式：经典；斜率灵敏度：0.2，峰宽：0.2，最小峰面积：2.0；最小峰高：0.1；积分时间：5~30min ；
以上参数仅供参考，可根据样品实际情况调整积分参数以保证基线平稳和积分一致，尽量避免手动积分，手动积分需主管确认和签字。

6.3 计算
采用面积归一化法计算，OpenLAB CDS 软件计算各峰的峰面积以及除溶剂峰和样品Buffer 峰外的总色谱峰面积，计算各组分区峰面积占总峰面积百分比的公式如下：
%
100主峰区A 酸性区A 碱性区A 主峰区
A %主峰区纯度⨯++=
%
100主峰区A 酸性区A 碱性区A 酸性区
A %酸性区纯度⨯++=
%
100主峰区A 酸性区A 碱性区A 碱性区
A %碱性区纯度⨯++=
6.4 数字格式
➢ 保留时间：小数点后3位； ➢ 峰面积%：保留小数点后1位；
➢ RSD%：大于等于1.0时，保留小数点后1位；小于1.0时，保留小数点后2位； ➢ 峰面积：整数； 6.4 接受标准
➢ 参比品色谱图与L 产品典型色谱图一致。

➢ 主峰保留时间的RSD %不大于 2.0。

➢ 主峰区总峰面积%的RSD %不大于 2.0。

➢ 总峰面积的RSD %不大于 2.0。

6.5 记录与报告
填写记录《C产品纯度测定离子交换谱法实验记录》（R-A-0021- ），保存色谱报告，按下表记录报告结果。

参考文件：
1.《中国药典》2015版第三部通则0512
附件：
1.离子交换色谱法（C项目）实验记录（共3页）R-A-0021-04 历史：。