第10章 动物基因工程
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200物遗传学
Northern杂交 Northern杂交
*
也称为Northern印迹（ 也称为Northern印迹（Northern Blot），用以检 Northern印迹 Blot）， ），用以检 测某一特定的RNA 通常是mRNA RNA（ mRNA） 测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在 及表达量。 及表达量。 因与DNA的杂交（ 因与DNA的杂交（Southern 杂交）相对应，故被 DNA的杂交 杂交）相对应， 趣称为Northern杂交。 Northern杂交 趣称为Northern杂交。
RNA来源： RNA来源：新鲜组织或细胞 来源
2008·秋
动物遗传学
DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、 DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒 提取方法
方法； 方法；
RNA提取： RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌 提取
或DEPC处理 DEPC处理
Genome DNA
Total RNA
20） Library）
含一种生物体的全部基因组DNA 含一种生物体的全部基因组DNA片。 DNA序列。 序列
动物遗传学
* *
2008·秋
第二节
基因体外重组技术
2008·秋
动物遗传学
1 重组质粒构建
载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行 是指携带靶DNA DNA片段进入宿主细胞进行
扩增和表达的工具。 扩增和表达的工具。
质粒是指一种存在于细胞内能独立复制的染色体外的 DNA。 DNA。
2008·秋
动物遗传学
2008·秋
动物遗传学
文 库 构 建
3 PCR
PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应 PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应 Reaction） （Polymerase Chain Reaction）, 是一种对特定的 DNA片段在体外进行快速扩增的新方法 DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 片段在体外进行快速扩增的新方法。
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动物遗传学
基因工程的基本操作
基因工程一般分为4个步骤： 基因工程一般分为4个步骤：
一、目的基因获取：取得符合人们要求的DNA片 DNA片 目的基因获取：取得符合人们要求的DNA 这种DNA片段被称为“目的基因” DNA片段被称为 段，这种DNA片段被称为“目的基因”； 基因体外重组： 二、基因体外重组：将目的基因与质粒或病毒 DNA连接成重组DNA； 连接成重组DNA DNA连接成重组DNA； 转化：把重组DNA引人某种细胞； DNA引人某种细胞 三、转化：把重组DNA引人某种细胞； 目的基因表达，获得有益性状或蛋白。 四、目的基因表达，获得有益性状或蛋白。
*
是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一 southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一 年创建用以鉴定DNA 特定的基因片段的技术，也称为Southern 特定的基因片段的技术，也称为Southern 印迹（ Blot）。 印迹（Southern Blot）。 通过标记的探针DNA与靶DNA结合， 通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基 DNA与靶DNA结合 因的存在及大小。 因的存在及大小。
PCR反应条件优化： PCR反应条件优化： 反应条件优化 引物设计： 引物设计：
2008·秋
动物遗传学
PCR的类型 PCR的类型
㈠巢式PCR 巢式PCR ㈡多重PCR 多重PCR 不对称PCR ㈢不对称PCR 共享引物PCR ㈣共享引物PCR 锚定PCR ㈤锚定PCR 彩色PCR ㈥彩色PCR - - - - 2008·秋
Southern杂交 Southern杂交
2、核酸杂交技术
（基于碱基互补配对） 基于碱基互补配对）
2008·秋
Northern杂交 Northern杂交 原位杂交
动物遗传学
序 列 测 定
Sanger等 1977）发明的双脱氧链末端终止法。 Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法。
Southern杂交 Southern杂交
原位PCR ㈦原位PCR ㈧定量PCR 定量PCR 差异显示PCR ㈨差异显示PCR 重组PCR ㈩重组PCR (十一)RT十一)RT (十一)RT-PCR 十二)RAPD (十二)RAPD - - - - 动物遗传学
基本概念
多重PCR: 多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列
的反应过程，能够节省时间和精力。 的反应过程，能够节省时间和精力。
编码的cDNA分子的克隆群 编码的cDNA分子的克隆群。 分子的克隆群。
cDNA是指以 cDNA是指以mRNA为模板，经反转录酶催化合成 是指以mRNA为模板 为模板， DNA，则此DNA序列与 DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补 序列与mRNA互补 互补， DNA或cDNA。 DNA或cDNA。 通常由RT-PCR获得 获得， 通常由RT-PCR获得，
锚定PCR 锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩 PCR：
增已知一端序列的目的DNA 增已知一端序列的目的DNA。 DNA。
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动物遗传学
巢式PCR 利用两套PCR引物对进行两轮PCR 巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反 PCR引物对进行两轮PCR扩增反
应组成，在第一轮扩增中， 应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产 此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。
动物基因工程，原称遗传工程，是应用DNA重组 原称遗传工程，是应用DNA DNA重组
技术，按照人们的意愿， 技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传 通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术； 性，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术； 或指应用现代化的生物科学和遗传学技术， 或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基 因进行操纵或改造的科学工程。 因进行操纵或改造的科学工程。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因 基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因 的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。
1)质粒图谱登记号：0052 质粒图谱登记号： 质粒图谱登记号 2)质粒名称：pBudCE4.1 质粒名称： 质粒名称 3)来源：Invitrogen 来源： 来源 4)用途：真核表达载体 用途： 用途 5) 详细资料 6)是否可以共享 是否可以共享 7)联系方式：PM 联系方式： 联系方式
定量PCR 定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR
终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR 终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量 PCR过程的监测 PCR起始模板量 的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA 的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA
克隆（clone） 指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系， DNA重组体的无性繁殖系 克隆（clone）：指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，
或指将DNA 或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程 DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程 (cloning)。 (cloning)。
基因克隆步骤： 获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目 DNA片段 ）；2) 基因克隆步骤：1) 获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目
*
由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获 1985年穆里斯 年穆里斯（ Mullis）发明， 得了1993年的诺贝尔化学奖 年的诺贝尔化学奖。 得了1993年的诺贝尔化学奖。
*
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动物遗传学
PCR的原理： PCR的原理： 的原理
体外DNA复制。 体外DNA复制。 复制
包括高温变性、低温退 包括高温变性、 火和中温延伸过程。 火和中温延伸过程。
/content/ 060125000010/01/text/pcr.htm
PCR反应五要素 PCR反应五要素
引物、 引物、酶、dNTP、模板和 2+ 、模板和Mg Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶
1）来自水生栖热菌 Thermusaquaticus；2）良好的耐 ） 热性； ） 依赖性； ） 热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能
第十章 动物基因工程
（Animal Genetic Engineering） Engineering）
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动物遗传学
主要内容 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
2008·秋
目的基因的获取 基因体外重组 转基因 基因敲除与基因诊断 动物克隆技术
动物遗传学
什么是动物基因工程？ 什么是动物基因工程？
2008·秋
动物遗传学
4 基因克隆
基因克隆（gene cloning）：或分子克隆,又称为重 cloning） 或分子克隆, 基因克隆（
DNA分 组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA 技术 子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子， 子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当 的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 DNA分子的过程 的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
2008·秋
动物遗传学
第一节
目的基因获取
2008·秋
动物遗传学
1 基因组DNA及总RNA的提取 基因组DNA及总RNA DNA及总RNA的提取
动物DNA的来源 动物DNA的来源（核、线粒体DNA） 线粒体DNA）
1. 血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、化石 血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、 ）、精液 及耳朵等活体组织； 及耳朵等活体组织； 2. 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K
差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞 差别显示ＰＣＲ：
mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构， mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此 可用含oligo dT） oligo（ 可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的 mRNA反转录成cDNA。 反转录成cDNA mRNA反转录成cDNA。
*
2008·秋
动物遗传学
原位杂交
* 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。
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动物遗传学
Western(印迹 Western(印迹)杂交 印迹)
*
蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹， 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即 检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合， 检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经 放射自显影显示条带， 放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋 白质表达量。 白质表达量。 DNA、RNA水平上的Southern杂交 Northern杂 水平上的Southern杂交、 与DNA、RNA水平上的Southern杂交、Northern杂 交相对应，称为Western杂交。 Western杂交 交相对应，称为Western杂交。 常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。 Northern印迹技术 常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。
的基因与载体在体外连接；３)重组DNA分子导入宿主细胞；４) 重组DNA分子导入宿主细胞； DNA分子导入宿主细胞 的基因与载体在体外连接； 筛选、鉴定阳性重组子； 重组子的扩增与／或表达。 筛选、鉴定阳性重组子；５)重组子的扩增与／或表达。
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动物遗传学
5 核酸分子鉴定
1、PCR结合测序： PCR结合测序
Northern杂交 Northern杂交
*
也称为Northern印迹（ 也称为Northern印迹（Northern Blot），用以检 Northern印迹 Blot）， ），用以检 测某一特定的RNA 通常是mRNA RNA（ mRNA） 测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在 及表达量。 及表达量。 因与DNA的杂交（ 因与DNA的杂交（Southern 杂交）相对应，故被 DNA的杂交 杂交）相对应， 趣称为Northern杂交。 Northern杂交 趣称为Northern杂交。
RNA来源： RNA来源：新鲜组织或细胞 来源
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动物遗传学
DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、 DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒 提取方法
方法； 方法；
RNA提取： RNA提取：所用器皿和试剂必需经高温灭菌 提取
或DEPC处理 DEPC处理
Genome DNA
Total RNA
20） Library）
含一种生物体的全部基因组DNA 含一种生物体的全部基因组DNA片。 DNA序列。 序列
动物遗传学
* *
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第二节
基因体外重组技术
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动物遗传学
1 重组质粒构建
载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行 是指携带靶DNA DNA片段进入宿主细胞进行
扩增和表达的工具。 扩增和表达的工具。
质粒是指一种存在于细胞内能独立复制的染色体外的 DNA。 DNA。
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动物遗传学
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动物遗传学
文 库 构 建
3 PCR
PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应 PCR，即聚合酶链式反应或多聚酶链反应 Reaction） （Polymerase Chain Reaction）, 是一种对特定的 DNA片段在体外进行快速扩增的新方法 DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。 片段在体外进行快速扩增的新方法。
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动物遗传学
基因工程的基本操作
基因工程一般分为4个步骤： 基因工程一般分为4个步骤：
一、目的基因获取：取得符合人们要求的DNA片 DNA片 目的基因获取：取得符合人们要求的DNA 这种DNA片段被称为“目的基因” DNA片段被称为 段，这种DNA片段被称为“目的基因”； 基因体外重组： 二、基因体外重组：将目的基因与质粒或病毒 DNA连接成重组DNA； 连接成重组DNA DNA连接成重组DNA； 转化：把重组DNA引人某种细胞； DNA引人某种细胞 三、转化：把重组DNA引人某种细胞； 目的基因表达，获得有益性状或蛋白。 四、目的基因表达，获得有益性状或蛋白。
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是southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一 southern于1975年创建用以鉴定DNA中某一 年创建用以鉴定DNA 特定的基因片段的技术，也称为Southern 特定的基因片段的技术，也称为Southern 印迹（ Blot）。 印迹（Southern Blot）。 通过标记的探针DNA与靶DNA结合， 通过标记的探针DNA与靶DNA结合，检测目的基 DNA与靶DNA结合 因的存在及大小。 因的存在及大小。
PCR反应条件优化： PCR反应条件优化： 反应条件优化 引物设计： 引物设计：
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动物遗传学
PCR的类型 PCR的类型
㈠巢式PCR 巢式PCR ㈡多重PCR 多重PCR 不对称PCR ㈢不对称PCR 共享引物PCR ㈣共享引物PCR 锚定PCR ㈤锚定PCR 彩色PCR ㈥彩色PCR - - - - 2008·秋
Southern杂交 Southern杂交
2、核酸杂交技术
（基于碱基互补配对） 基于碱基互补配对）
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Northern杂交 Northern杂交 原位杂交
动物遗传学
序 列 测 定
Sanger等 1977）发明的双脱氧链末端终止法。 Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法。
Southern杂交 Southern杂交
原位PCR ㈦原位PCR ㈧定量PCR 定量PCR 差异显示PCR ㈨差异显示PCR 重组PCR ㈩重组PCR (十一)RT十一)RT (十一)RT-PCR 十二)RAPD (十二)RAPD - - - - 动物遗传学
基本概念
多重PCR: 多重PCR:是指在一个单一反应中同时扩增多个序列
的反应过程，能够节省时间和精力。 的反应过程，能够节省时间和精力。
编码的cDNA分子的克隆群 编码的cDNA分子的克隆群。 分子的克隆群。
cDNA是指以 cDNA是指以mRNA为模板，经反转录酶催化合成 是指以mRNA为模板 为模板， DNA，则此DNA序列与 DNA，则此DNA序列与mRNA互补，称为互补 序列与mRNA互补 互补， DNA或cDNA。 DNA或cDNA。 通常由RT-PCR获得 获得， 通常由RT-PCR获得，
锚定PCR 锚定PCR：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩 PCR：
增已知一端序列的目的DNA 增已知一端序列的目的DNA。 DNA。
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巢式PCR 利用两套PCR引物对进行两轮PCR 巢式PCR：利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反 PCR引物对进行两轮PCR扩增反
应组成，在第一轮扩增中， 应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产 此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。 物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。
动物基因工程，原称遗传工程，是应用DNA重组 原称遗传工程，是应用DNA DNA重组
技术，按照人们的意愿， 技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传 通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术； 性，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术； 或指应用现代化的生物科学和遗传学技术， 或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基 因进行操纵或改造的科学工程。 因进行操纵或改造的科学工程。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因 基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因 的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。
1)质粒图谱登记号：0052 质粒图谱登记号： 质粒图谱登记号 2)质粒名称：pBudCE4.1 质粒名称： 质粒名称 3)来源：Invitrogen 来源： 来源 4)用途：真核表达载体 用途： 用途 5) 详细资料 6)是否可以共享 是否可以共享 7)联系方式：PM 联系方式： 联系方式
定量PCR 定量PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR PCR技术是指以外参或内参为标准,通过对PCR
终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR 终产物的分析或PCR过程的监测,进行PCR起始模板量 PCR过程的监测 PCR起始模板量 的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA 的定量。用于扩增已知一端序列的目的DNA
克隆（clone） 指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系， DNA重组体的无性繁殖系 克隆（clone）：指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系，
或指将DNA 或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程 DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程 (cloning)。 (cloning)。
基因克隆步骤： 获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目 DNA片段 ）；2) 基因克隆步骤：1) 获得待克隆的DNA片段（基因）；2)目
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由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获 1985年穆里斯 年穆里斯（ Mullis）发明， 得了1993年的诺贝尔化学奖 年的诺贝尔化学奖。 得了1993年的诺贝尔化学奖。
*
2008·秋
动物遗传学
PCR的原理： PCR的原理： 的原理
体外DNA复制。 体外DNA复制。 复制
包括高温变性、低温退 包括高温变性、 火和中温延伸过程。 火和中温延伸过程。
/content/ 060125000010/01/text/pcr.htm
PCR反应五要素 PCR反应五要素
引物、 引物、酶、dNTP、模板和 2+ 、模板和Mg Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶
1）来自水生栖热菌 Thermusaquaticus；2）良好的耐 ） 热性； ） 依赖性； ） 热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能
第十章 动物基因工程
（Animal Genetic Engineering） Engineering）
2008·秋
动物遗传学
主要内容 第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
2008·秋
目的基因的获取 基因体外重组 转基因 基因敲除与基因诊断 动物克隆技术
动物遗传学
什么是动物基因工程？ 什么是动物基因工程？
2008·秋
动物遗传学
4 基因克隆
基因克隆（gene cloning）：或分子克隆,又称为重 cloning） 或分子克隆, 基因克隆（
DNA分 组ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分 ＤＮＡ技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA 技术 子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子， 子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当 的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 DNA分子的过程 的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。
2008·秋
动物遗传学
第一节
目的基因获取
2008·秋
动物遗传学
1 基因组DNA及总RNA的提取 基因组DNA及总RNA DNA及总RNA的提取
动物DNA的来源 动物DNA的来源（核、线粒体DNA） 线粒体DNA）
1. 血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、化石 血液、毛发、皮屑（口腔上皮细胞）、精液、 ）、精液 及耳朵等活体组织； 及耳朵等活体组织； 2. 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K
差别显示ＰＣＲ：是根据绝大多数真核细胞 差别显示ＰＣＲ：
mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构， mRNA3’端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此 可用含oligo dT） oligo（ 可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸为引物将不同的 mRNA反转录成cDNA。 反转录成cDNA mRNA反转录成cDNA。
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动物遗传学
原位杂交
* 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位。 * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆。
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Western(印迹 Western(印迹)杂交 印迹)
*
蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹， 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即 检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合， 检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经 放射自显影显示条带， 放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋 白质表达量。 白质表达量。 DNA、RNA水平上的Southern杂交 Northern杂 水平上的Southern杂交、 与DNA、RNA水平上的Southern杂交、Northern杂 交相对应，称为Western杂交。 Western杂交 交相对应，称为Western杂交。 常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。 Northern印迹技术 常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控。
的基因与载体在体外连接；３)重组DNA分子导入宿主细胞；４) 重组DNA分子导入宿主细胞； DNA分子导入宿主细胞 的基因与载体在体外连接； 筛选、鉴定阳性重组子； 重组子的扩增与／或表达。 筛选、鉴定阳性重组子；５)重组子的扩增与／或表达。
2008·秋
动物遗传学
5 核酸分子鉴定
1、PCR结合测序： PCR结合测序