细胞生物学综合实验报告

（2）.许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。
流程：制片
计数
4、实验方法步骤及注意事项：
Ⅰ、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）
（一）清洗
(1).新玻璃器皿的清洗
先用自来水刷洗，再浸泡Hale Waihona Puke Baidu%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。
(2).使用过的玻璃器皿的清洗
（3）使用过的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/L NaOH或0.2mol/L HCl溶液中，清水洗过，自来水清洗10次晾干，进洗液2~24h。晾干，放入饭盒高压灭菌，备用
（五）洗液的配制
（1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。
（2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。
(4)吸去上清夜，加入适量的培养液，用吸管打匀制成细胞悬液。
(5)重复步骤1，计算细胞数，加入适量培养液把最终细胞数调节至1×105～3×105个/mL。
(6)把细胞悬浮分装至新备的细胞培养瓶中，置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。
Ⅳ、死活细胞的鉴别
（1）取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。
（3）干热灭菌
主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160度，保温90~120min。用于RNA提取实验的用品则需要180度，保温5~8h.
（4）湿热灭菌
也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。
（5）滤过灭菌
（2）取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。
(3）低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方
准备（清洗与灭菌）
流程：
3、细胞传代培养
（1）当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后，则需要在培养，即将培养的洗吧分散后，以适当的比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。
（2）悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大
材料：细胞培养瓶、血球计数板、滴管、培养细胞
试剂：台盼蓝（染料）、乙醇
（四）死活细胞的鉴别
仪器：显微镜、血球计数板
材料：结肠腺癌320细胞
试剂：0.4%台盼蓝溶液
3、 实验原理及实验流程或装置示意图：
（一）原理及示意图：
1、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）
原理：
（1）清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
（3）细胞计数，四大格细胞数分别是：活细胞45个，死细胞4个。
2、对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论：
进过细胞染色后，在电子显微镜下可以观察到宫颈癌细胞，活细胞不着色较透明，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，不健康或已死亡的细胞。
根据上述数据所示，每毫升原液细胞数:245000个；细胞存活率为 83.7% ，细胞生长处于稳定期。
6、我们小组的细胞死亡有可能是我们操作中从灭菌操作台外拿进去的试剂及用具上的细菌没有完全被灭火。
7、用移液器转移液体的过程中被污染，导致细胞受细菌感染。
8、在细胞培养瓶放入培养箱中，外面的大量细菌污染了培养箱里的空气。
9、细胞培养瓶塑料盖拧太松导致空气里的细菌污染了培养瓶里的细胞。
10、在培养基调节pH值时没有pH试纸，所以有可能培养基pH值没有达到宫颈癌细胞生长条件。
A、立即进入清水，避免干涸难洗；
B、用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；
C、浸酸性洗液过夜；
D、从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；
E、包装（牛皮纸或不透水纸）；
F、高压（15磅20min)或干热（160度2h)灭菌；
G、备用
（二）胶塞处理
（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。
（4）浸泡在70%乙醇0.5~1h,备用。
（5）用前从乙醇中取出，在超级工作台内紫外线照射1h。
（四）Tip和Tube的清洗
（1）新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。
（2）用于RNA提取时，用蒸馏水刷洗后再用DEPC水（抑制RNA酶）浸泡过夜晾干，高压灭菌后使用。
3、结论：
（1）根据每毫升原液细胞数=4大格中的细胞总数/4 × 10000× 稀释倍数
细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数
计算得出：每毫升原液细胞数:245000个
细胞存活率（%）:83.7%
（2）我们小组宫颈癌HeLa细胞株培养中我们小组培养瓶为粉红色还有少许沉淀，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，不健康或已死亡的细胞。在显微镜下观察到我们培养的细胞基本死了，有少数细胞活着。
流程：
胶塞处理
塑料制品的清洗
消毒和灭菌
洗液的配制
2、培养基的配制
细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。
合成培养基的配制
本科学生实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级
实验课程名称细胞生物学实验
指导教师及职称王莎莎
开课时间2013至2014学年第一学期
填报时间2013年10月13日
云南师范大学教务处编印
实验名称：实验五、宫颈癌HeLa细胞株培养
实验时间：星期二上午一、二节课
小组合作：是
一、实验预习
1、实验目的
（一）、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）
流程：
每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内
然后向细胞培养瓶内接种10ul的结肠腺癌320细胞株培养株原液
放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖
根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置
4、死活细胞的鉴别
（1）.细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。
（2）体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。
（3）灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了→营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
清洗
Tip和Tube的清洗
2、是严格控制无菌条件。
Ⅲ、细胞传代培养
(1）选取拟作传代培养的样本，取0.5mL细胞悬浮液加入等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。如果样本成活率高，无污染即可用于传代。
(2)用弯头吸管将原代培养瓶内的细胞吹打均匀，注意将那些半贴壁生长的细胞吹打脱离以免在移换容器时丢失。
(3)把细胞悬液吸入无菌离心管中，塞紧反口橡皮塞以防止空气污染，用1000r/min离心5min。
能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
（二）、培养基的配制
熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。
（三）、细胞传代培养
熟练掌握细胞传代培养的操作方法；
观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。
（四）死活细胞的鉴别
掌握死活细胞的鉴别原理及方法
2、实验设备及材料
（一）细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）
仪器：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器
材料：微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um
试剂：75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、HCl等
（二）培养基的配制
仪器：超净工作台、高压灭菌锅、多重蒸馏水、器磁力搅拌器、天平、微量加样器
材料：细胞培养瓶、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器（0.22μm）及注射器、各种规格的Tip、离心管
试剂：NaOH、酚红、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、NaHCO3、L-谷氨酰胺
（三）细胞传代培养
仪器：超净工作台、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、光学显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱二氧化碳培养箱
三、实验总结
次实验成败之处及其原因分析、改进措施：
（1）、清洁操作中，未洗净仪器，含有杂菌；
（2）、超菌工作台与空气大面积接触且灭菌时间过短，参有大量杂菌；
（3）、RPMI 1640培养基的配制过程中本次试验由于初次进行细胞的培养，经验不足以至于最后培养出的培养液比较浑浊，宫颈癌细胞被杂菌感染，大部分已经死亡。主要被杂菌污染的操作步骤在于RPMI 1640合成培养基的配制过程中，小组成员熟悉实验操作，多人合作完成一个实验步骤，从而培养液被污染了。
（2）自来水清洗10次
（3）用1%稀盐酸浸泡30min。
（4）自来水清洗10次，蒸馏水刷洗10次。晾干
（5）旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装高压灭菌，可使用。
（三）塑料制品的清洗
（1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍
（2）强（次强）酸洗液浸泡2~6h.
（3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次
（3）悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。
每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基
（2）配制好的培养基，用时用饱和 NaHCO3液调节 pH 至 6.8-7.0。
溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。
（3）瓶口封好，-20℃或4 ℃贮存。
注意：
1、是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节；
用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。
（七）化学消毒法
（1）70%（75%）酒精消毒
（2）0.1%新洁尔灭消毒
（3）来苏儿水消毒
（4）0.5%过氧乙酸消毒
（5）乳酸蒸汽消毒
（6）37%甲醛加高锰酸钾消毒
（7）煮沸消毒
Ⅱ、培养基的配制 （RPMI 1640 合成培养基配制）
（1）加入 0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。
注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。
（六）消毒和灭菌
（1）射线消毒灭菌
主要使用X、60Co进行消毒灭菌，用于牛血清或塑料制品。
（2）紫外线消毒
一般用无臭氧型紫外灯。一般20min，71%细菌消灭；40min后79%细菌消灭，60min后86%细菌消灭。紫外线照射时间照射再长也不能100%灭菌，最多只能达到90%。
（4）细胞在计数过程中时间太长导致细胞计数细胞总数偏少。
（5）细胞计数光学显微镜计数不够精确，而且光学显微镜数目不够。
优点：经过本次试验，我们了解细胞培养的基本过程和步骤。并培养了团队合作精神，从中获益匪浅；在其它操作和细胞计数中比较成功的完成了实验的各个步骤，是值得肯定的。
Ⅴ、实验数据处理：
每毫升原液细胞数=4大格中的细胞总数/4×10000 × 稀释倍数
细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数
二、实验内容
1、实验现象、数据及观察结果：
（1）宫颈癌HeLa细胞株培养中我们小组培养瓶为粉红色还有少许沉淀，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，不健康或已死亡的细胞。
（2）在显微镜下观察到我们培养的细胞基本死了，有少数细胞活着。
分析原因：
1、光学显微镜数量不够，每四个人一台显微镜。
2、由于等待前一组同学细胞计数，我们细胞被染色时间过长，有可能细胞有些已经死亡或有活细胞已被着色。
3、细胞液没有摇晃均匀，显微镜镜头有杂质，影响计数。
4、光学显微镜计数不够精确，误差较大。
5、我们组在和其他小组结果讨论的时候发现我们的细胞数偏少，有可能的原因是由于我们细胞染色后到观察这一时间过于长或者是细胞悬液没有充分混匀。