超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶(SOD)的生产工艺研究

摘要

本文主要介绍SOD的作用和两种不同的生产工艺。通过一种传统的SOD生产工艺和一种利用选择性热变性的方法的牛血SOD提取生产工艺的对比研究从而反应出，由如今对SOD的需求而需要一种较新的生产工艺来取代传统工艺。讨论如何保证质量，提高酶的回收率和降低成本。

前言

在人体的正常新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。如辐射、电磁波、汽车尾气、工业废气、废水的污染均会让体内产生过量的自由基。而自由基不到会引起人体衰老，还会让人体产生各种疾病如风湿性关节炎、癌症、高血压、肾脏病、白内障等等。SOD 是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！

关键字: SOD 猪血分离纯化鉴定

材料：牛血、猪血、0.9%NaCl、95%乙醇、氯仿、丙酮、去离子

方法一:

工艺流程图

工艺要点:⑴收集、浮洗新鲜猪血经离心去除黄色血浆,红细胞用0.9%NaCl溶液离心浮洗3次，收集红细胞。

⑵溶血、去血红蛋白收集洗净的红细胞，加去离子水，在5℃下搅拌30min,然后加入0.25倍体积的95%乙醇和0.15倍体积的氯仿,搅拌15min;离心去血红蛋白,收集上清液。

⑶沉淀、热处理将上清液加入1.2~1.5倍体积的丙酮，产生絮状沉淀；离心去上清液，得沉淀物，操作要在0℃左右进行；沉淀物加适量蒸馏水使其溶解，离心除去不溶性蛋白;上清液于55~65℃热处理10~15min,离心除去热变性蛋白,收集黄绿色澄清液。⑷沉淀、去不溶蛋白0℃条件下，在澄清液中加入适量丙酮，使其产生大量絮状沉淀；离心弃去上清液，沉淀用去离子水溶解；离心除不溶性蛋白；上清液置透析袋中，得透析液。

⑸吸附、洗脱将透析液加到用2.5mmol/L、PH7.6的磷酸缓冲液平衡好的DEAE Sephadex A50柱上吸附，用2.5~5mmol/L、PH7.6磷酸钾缓冲液梯度洗脱，收集SOD活性洗脱液。猪血SOD 的吸收峰为250nm

⑹超滤、冻干将SOD活性洗脱液超滤浓缩后，冷冻干燥，即可得外观带线蓝色的Cu/Zn-SOD成品。

方法二:

工艺流程图

⑴溶血液制备:新鲜牛血以3.8%柠檬酸钠抗凝血球分离机分离红细胞,加2倍无离子水搅拌溶血30min。

⑵选择性热变性：溶血液泵入夹层反应釜，搅拌、蒸汽加热至68℃，加入适量蛋白质沉淀剂使血红蛋白变性后，将反应液泵入冷却罐，搅拌机搅拌，迅速冷却至15℃，按反应液总体积补加适量蛋白质沉淀剂，搅拌1h，甩干过滤去除变性血红蛋白，过滤液3000rpm20min低速离心，去除颗粒沉淀物。

⑶超滤浓缩：上清液经微孔过滤去除细微颗粒，经超滤器超滤浓缩至总体积的1/200，收集浓缩液。

⑷丙酮沉淀：超滤浓缩液预冷至4℃，加入等体积预冷的工业丙酮，放置1h，4000rpm30min冷冻离心，沉淀用少量无离子水回溶，对无离子水透析12h，4000rpm30min冷冻离心，收集上清液。柱层析：经处理的DEAE-52装柱，用25mM/Lph7.8PB缓冲液，缓慢上样，用ph7。8PBS 25-200mM/L梯度洗脱，收集SOD部分，对无离子水透析12h。

⑸冷冻干燥：透析后的酶液经浓缩，置冻干机内冷冻干燥，升温速率控制在5℃/h

鉴定方法

SOD酶活力测定：采用邻苯三酚自氧化法，25℃自氧化速率0.07，PH8 2，50mM Tris-Hcl缓冲液

蛋白质浓度测定：采用Lowry法，以250ug/ml BSA作标准曲线分子量测定：采用SDS-PAGE电泳法，浓缩胶3.5%分离胶10% 紫外吸收光谱检测：扫描波长发威230~300nm。

结果与讨论

血SOD的制备从实验室走向规模工业化生产，关键问题在于保证质量，提高酶的回收率和降低成本，通过多次重复实验与研究，建立了红细胞连续分离技术，并证明冷冻血球和新鲜血球制备的SOD在收率、纯度、比活等发面无明显差别；。两种方法的工艺流程做比较，方法二的稍微要简单一点，虽然两个流程均是

用分离纯化的方法来提取SOD但是，方法二利用了热变性来去除血红蛋白，与方法一做比较中省去了传统工艺中所用的大量氯仿和乙醇；利用超滤技术浓缩提取液可大幅度度减少丙酮用量；应用SOD重组技术，对SOD生产中丢失铜锌离子的酶蛋白恢复酶的催化活性，方法二的工艺在保证SOD质量和收率的前提下有效降低成本。牛血SOD的制备从实验室走向规模工业化生产，关键问题在于保证质量，提高酶的回收率和降低生产成本。