级细胞模型实验报告

广西医科大学

实验报告

科目：细胞模型实验

年级：研究生院2016级

组别： A组

学号： *************

姓名： ********

实验二 MTT法测定药物对细胞生长的抑制作用

实验原理：

ＭＴＴ比色法原理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶能将淡黄色的ＭＴＴ还原为蓝紫色的结晶甲臜。后者结晶产物的量与活细胞数目成正相关，而死细胞或红细胞没有此功能。结晶用ＤＭＳＯ、无水乙醇、酸化异丙醇等溶解，在酶标仪上以波长为490ｎｍ进行比色,所检测吸光值的大小可反应细胞代谢活性的强弱。

实验步骤：

1：贴壁细胞消化和吹打：加%胰蛋白酶并轻摇使其遍布所有细胞表面至镜下观察发现胞质回缩、间隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培养液,反复吹打至瓶壁上无贴壁细胞为止。

2：计数与分板：取20ul细胞悬液于计数板计数,用1640培养液调整使其细胞数约为5×104个/ml,在96孔培养板中加入细胞悬液每孔100ul,共18个,培养箱孵育12h。

3：加药与孵育于培养板中分别加入浓度为,,,,ml环磷酰胺注射液各100ul,每组

重复3孔,设空白对照组3孔各100ul,孵育24小时。

4：MTT显色每孔加MTT20ul，3小时候弃上清，每孔加DMSO100ul。

5：酶标仪测定：490nm处测其吸光度

实验结果及讨论:

1.不同浓度药物的生长抑制率如下

抑制率（%）存活率（%）

浓度（ug/ml）平均吸光度（x

±s）

1600 % %

800 % %

400 % %

200 % %

100 % %

0 % %

2.浓度与抑制率关系图

注：横坐标为浓度对数值、纵坐标为抑制率

3.讨论：

1.本次实验出现错误较多，OD值出现负值和其中还有400ug/ml组加悬液过量，致使数据有所偏离。

2.加DMSO之后颜色对比明显，并且梯度效果比较好，平行孔间颜色较均匀，随浓度梯度变化相对明显，能够体现出抑制作用。

3.实验数据过少不能够完全判定药物的抑制作用，另因为如果孔内的细胞状态不好也有可能导致细胞死亡。

实验三HE染色法观察药物作用细胞后的形态学变化

实验原理：

HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，使细胞微细结构通过颜色而改变它的折射率,从而在光镜下能清晰显示出细胞图像,染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。

实验步骤：

1.样品制备:胰酶消化贴壁生长细胞,调整细胞浓度为1×105个/ml,每孔2ml加

于6孔板,加盖玻片,加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次。

2.样品固定:95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。

3.染细胞核:苏木精染色5-10min后自来水水洗。

4.染细胞质:伊红染色1-2min后自来水水洗。

5.脱水、透明:70%，95%，100%乙醇逐级脱水,二甲苯透明,吹干。

6.封片:在载玻片上滴加甘油，将有细胞的一片的盖玻片向下封固于载玻片上。实验结果及分析:

染色的结果是酸性的细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，碱性的细胞质被酸性的伊红染成红色。如图所示染色的结果随药物浓度变化而变化，药物对细胞的抑制作用较为明显，并且体现出浓度趋势，整体的染色效果尚可。

实验四吖啶橙荧光染色法观察细胞形态学的变化

实验原理：

吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料，在蓝色光或紫外光的激发下，DNA和RNA都会激发出荧光，活细胞经过固定，染色后细胞DNA成亮绿色，核仁和散布在细胞质中的RNA成橘红色，胞质的其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因

为物质就够发生变化，其细胞核成暗绿色，细胞质也是成暗绿色。

实验步骤：

1.胰酶消化贴壁细胞,调整细胞浓度为1×105/ml,每孔2ml加于6孔板,加盖玻片,

加入药物培养相应时间,取出盖玻片,用PBS洗涤3次,除去血清

2.95%乙醇固定15~30min

3.1%醋酸作用30s，1×10-4AO染色30s~60s，CaCl2处理30s~2min

4. PBS漂洗3次

5.甘油封片

实验结果及分析：

对照组 IC50组正常细胞染色后发出绿色荧光，密度不均匀呈结构样特征，而凋亡小体边缘清晰，呈染色增强，荧光亢进且密度均一，实验组与对照组实验结果对照明显，可见细胞数量在加药组减少。有细胞正在进行分化，还有分化刚刚结束有细胞正在进行分化，还有分化刚刚结束。

实验五TRIzol试剂快速分离细胞和组织中的RNA、ＤＮＡ、蛋白质

实验原理：

TRIzol试剂是目前最常用的细胞和组织中分离ＲＮＡ的试剂，其主要成

分是苯酚，苯酚的作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白和核酸物质释放，由于ＲＮＡ极易被ＲＮａｓｅ分解，所以TRIzol中常加入８－羟基喹啉，异硫氰酸胍等来抑制内源性和外源性ＲＮａｓｅ活性，以保证ＲＮＡ完整。TRIzol试剂还利用RNA、ＤＮＡ、蛋白质在不同溶液中的溶解性质,加入氯仿离心后,溶液分为水相、中间层和有机相,取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中间层可回收DNA,

用异丙醇沉淀可回收蛋白质,从而实现三者快速分离。

实验步骤：

样品处理:TRIzol处理后的样品在室温放置5min,每使用1mlTRIzol加入氯仿,剧烈震荡15s,室温放置3min,离心15min.样品分三层:底层为红色有机相,上层为无色水相和一个中间层.RNA主要在水相,中间层和有机层用于分离DNA和蛋白质。

RNA:

放置干燥RNA沉淀，用无Rnase水在55-60度下溶解ＲＮＡ

取２ｕｌ样品用核算微量检测仪测量ＲＮＡ浓度

另取２ｕｌ在琼脂糖凝胶中跑电泳

DNA：

75%乙醇洗DNA沉淀后再离心

试问晾干后NaOH溶解，再用TE，HEPES调节PH

取2ul在核算微量检测仪上测量ＤＮＡ浓度

蛋白质：

室温晾干后１％ＳＤＳ溶解蛋白质

双缩脲试剂检验

实验结果及分析：

1、RNA电泳图如下：可以看到28， 18s，5s三条条带

2.

OD（260nm）/OD（280nm）浓度

RNA ng/ml

DNA ng/ml