现代生物技术进展答案

现代生物技术进展答案

1.激光共聚焦扫描显微镜有什么特点？

1光源：用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。

2共聚焦技术：在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住。

3点扫描技术：共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。也就是通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z Z 轴重叠就可形成一个完整的三维图象

普通光镜：是在可见光源下一次性成像。

4信号放大、电子图像：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。

5软件：计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像，得到的图象是数字化的，可以在电脑中进行处理，再一次提高图象的清晰度。

优势：在结构方面：激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高，可实现分

层扫描，可实现连续扫描，可动态记录变化，可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像，扫描速度快，对样品损伤小。

在效果方面：更灵敏：共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。

定位更精确：不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。定量测量。静态的定量测量：对于不同组的样品，可以单纯比较一种成分，也可以同时比较两种甚至三种成分。也可以在同一张切片上比较不同成分含量。动态的定量测量：共聚焦显微镜还能对活细胞内的特定成分（如：钙、

钠、氢等）进行动态变化测量，并给出动态变化曲线；还可以同时测量几种成分，并给出含量比值。

快速性：由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。数据图像可及时输出或长期储存：用计算机代替了普通的照相机，得到的图像是数字化的，不存在暴光方面及胶卷冲洗方面的问题（如荧光太弱，无法暴光；或曝光过程中荧光淬灭等）；而且图像可进一步加工处理。

2.与静态细胞观察相比，活细胞观察有哪些优势？

3.绿色荧光蛋白如何发出绿色荧光？

水母体中有一种发光蛋白Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收从而发出绿色荧光，这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质就是GFP。GFP生色团： Ser 65- - Tyr 66- - Gly 67，

GFP中丝氨酸65展开多肽骨架环化形成咪唑啉酮环系统形成通过脱氢反应-H2O 形成环化环系统在经过氧化反应+O2 形成成熟绿色荧光发色基团，发绿色荧光。

荧光的发光是被一定波长光激发后，电子被激发到高能级，随后向低能级跃迁的过程中发出比激发光波长更长的荧光，这也就是上面提到的受激辐射。我们将能接受光辐射，并跃迁发出颜色光的基团叫做生色团。绿色荧光蛋白含有一个三肽的单位Ser（65）-Tyr（66）-Gly（67），在蛋白质折叠的时候，这三个氨基酸会折叠成5元环的咪唑酮的结构，也就是生色团。当它被激发后，失去一个质子，形成了带负电荷的结构，在这种构象下就可以发光了。

4.与传统的荧光素相比，绿色荧光蛋白应用于蛋白质的荧光标记时有哪些

优缺点？

5.与荧光素酶相比，绿色荧光蛋白作为报告基因有哪些优缺点？

6.举例说明绿色荧光蛋白可以应用于哪些方面？

（1）报告基因：可以监控细胞内活动；可以进行细胞筛选（FACS）：例如，可以在

胚胎或成体复杂的组织中分离得到表

达荧光蛋白的活细胞，通过荧光激活细

胞分选，我们可以通过解剖分离含有目

的的荧光蛋白的组织，然后酶消化成单

个细胞，流式分选出表达目的的荧光蛋

白的活细胞；还可用作蛋白质定位，如

果蛋白质进入则颜色会叠加；可用来观

测基因的表达水平。

（2）转基因动物：主要是GFP在肿瘤研究中的应用，例如可以通过荧光的强弱判断

肿瘤的大小与深度，内部的肿瘤所发出

的荧光由于受周围组织，尤其是皮肤的

干扰，小的瘤灶常难以显示，因此我们

可以在欲检测的器官做一个可逆性的

皮瓣，观察时打开皮瓣，建立荧光通路。（3）传感器：检测细内PH，绿色荧光蛋白可以激活FP，转换FP，开关FP。光漂白

恢复：光漂白（ photo bleaching ）

指在光的照射下荧光物质所激发出来

的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃

至消失的现象。借助于高强度激光来照

射细胞某一区域，造成该区域荧光分子

的光淬灭（即漂白），该区域周围的非

淬灭荧光分子会以一定的速率向受照

射区域扩散，这个扩散速率可通过低强

度激光扫描探测，因而可得到活细胞的

动力学参数。

7.为什么说“蛋白质药物开发是独一无二的挑战”？

8.常用的包涵体复性方法有哪些？有何优缺点？

常用方法：稀释法，透析法，超滤法，液相色谱法

优点：复性条件比较温和、层析介质的隔离降低了蛋白相互作用产生的聚集；可同时实现蛋白质的复兴和纯化，耗时少；回收率高、快速、易放大、样品稀释倍数小（一般5倍左右）

缺点：很难避免在交换溶液时变性蛋白聚体形成少量沉淀，并且吸附在凝胶介质，造成复性率和柱子载样量降低

11.与非重组蛋白相比，重组蛋白在特性描述方面有何特别之处？

12.药用蛋白制备过程中必须去除的3种特殊物质是什么？如何去除？

DNA、热源和病毒是蛋白质纯化过程中尤其需要重视的3种潜在的非蛋白质杂质。

DNA：每剂药用蛋白中DNA含量<10 pg,接受治疗的病人没有被诱发肿瘤的危险。DNA (pH>4. 0时) 是一个强阴离子分子，可在合适的条件下吸附到阴离子交换色谱上，利用此特点可去除DNA。 DNA 不会吸附于亲和色谱柱和疏水色谱柱，因此利用此特点也可去除DNA。

热源：注射用药用蛋白要求最终达到无热源状态，否则会引起被注射者发烧、发冷、改变血管渗透性或其他副作用，这种反应为热源反应，生化或药用产品中任何引起该种