外泌体代谢组学研究策略

Contents

PART 01

代谢研究新热点——外泌体

PART 02

外泌体在医学研究的应用

PART 03

经典案例解析

代谢研究新热点—

外泌体

外泌体——国自然热点

截至2019年10月，外泌体相关的国家自然科学基金中标总计已达2.13亿元，较2018年

外泌体研究价值

运载内源性的脂质、核酸、蛋白

质、miRNA等信息物质

参与机体免疫应答、细胞迁移、

肿瘤侵袭、抗原提呈等

细胞间通讯、疾病诊断和预后循环

生物标志物的重要载体

外泌体发展历程

近30年的发展历史，从无到有，由冷到热

外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。

“小船过河”

靶细胞A靶细胞B

“打劫”

病毒

正常细胞和病理状态的细胞都可以分泌外泌体。每个组织部位的外泌体不同，靶向结合受体也不同。

外泌体结构

目前研究发现外泌体中富含核酸、蛋白、胆固醇等。可用于基因水平、蛋白水

平、代谢水平的研究，成为

疾病诊断和医疗的强有力工具。

细胞外囊泡

外泌体：直径40-100nm，内吞微囊泡：直径100-1000nm，出芽

凋亡小体：直径1050-2000nm，凋亡

诱导胆固醇堆积

外泌体与抗原提呈细

胞识别的主要途径

介导树突状细胞摄取外泌体近距离：直接与靶细胞的细胞膜融合，非选择性地释放信息物质。

作用方式

1）直接与靶细胞的细胞膜融合。2）通过内吞作用被靶细胞摄取。

3）识别细胞表面的特异性受体。

外泌体主要功能

细胞间通信、疾病的传播及组织修复

1）将膜蛋白或其内容物转移至受体细胞；

2）直接与受体细胞膜融合；

3）跨膜蛋白直接作用于受体细胞膜表面的信号分子。

4）可以通过介导促炎症反应来促进免疫反应；5）肿瘤细胞分泌的外泌体促进癌症的侵袭和转移，加快血管生成，抑制免疫反应，增强肿瘤的耐药性。

外泌体与疾病

●外泌体与肿瘤

● 外泌体与干细胞

● 外泌体与心血管疾病

● 外泌体与免疫疾病

● 外泌体与神经疾病

外泌体在医学研究

的应用

外泌体应用方向

一、寻找疾病诊断和预后的分子标志物。

外

泌

体应用方向二、揭示疾病发病机制，从微环境角度解释细胞之间通讯促进疾病发生的原因。

三、外泌体作为药物载体，实现靶向给药。

外泌体脂质用于分类早期和晚期非小细胞肺癌

研究背景：早期肺癌患者手术切除肿瘤的预后最好，但是在进展为晚期疾病之前，该疾病通常是无症状的，并且尚无有效的基于血液的筛查方法可用于在高危人群中早期发现肺癌。

健康（n=39）、肺癌早期（

n=44） 、肺癌晚期（n=47）

LC-MS检测

Biomarker

16种脂质健康VS非小细胞肺癌早期

外泌体&癌症（机制）

重新编程代谢机制：

1）抑制线粒体氧化磷酸化，从而增加癌细胞的糖酵解和谷氨酰胺依赖性还原羧化；

2）13C标记的同位素标记，外泌体以类似于大胞饮作用的机制向营养缺乏的癌细胞提供氨基酸，脂质和TCA循环中间体等。

成纤维细胞

葡聚糖

外泌体&免疫

抑制免疫：有研究证明病毒利用外泌体在宿主靶细胞之间自由穿梭和准确定位的

特点，“劫持”外泌体，将病毒致病相关蛋白、基因组甚至毒粒，转运到全身

各处。

促进免疫：外泌体携带功能性抗原肽复合物介导抗

病毒免疫，从而有效降低宿主对感染的易感性。

外泌体研究流程

“天然纳米粒子”

实验取材

外泌体取样指南

1）细胞培养上清：优势：不会受到样本量的限制。注意：一不能添加含有外泌体的FBS；二是细胞一般培养24-48h后即可分离外泌体；三是注意细胞不允许有污染、细胞死亡率要控制在5%之内。

2）血清/血浆：尽量在采血30min内处理样本，分理出血浆和血清，因血液收集在收集管中时，血细胞和血小板还会分泌外泌体。

3）尿液：要注意选取中间段的尿液，确保尿液的新鲜度，并注意避免细菌污染。

经典案例解析

案例分享1

代谢组学可识别胰腺癌的血清和外泌体代谢标志物

仪器：LC-MS 样本：血清外泌体

研究思路

疾病VS对照

LC-DDA-MS的非靶向脂质组

Biomarker

LC-MRM-MS的靶向脂质定量

LysoPC 22：0，PC（P-14：0/22：2）和PE（16：0/18：1）与肿瘤分期、肿瘤直径等相关；PE（16：0/18：1）与患者生存率相关。270种脂质61种脂质

1.实验分组

胰腺癌患者的外周血（PB）

胰腺癌患者的癌旁血（PCB）

和 健康人的血液（C）

2. 外泌体分离和鉴定

a.外泌体通过扫描电子显微镜检查。

b.Western印迹通过抗CD63验证了外泌体（微

管蛋白用作内部对照）。

3.非靶向脂质组学分析（DDA‑MS）

PB组和C组之间脂质变化趋势的热图PCA得分图（四个组）

（酰基肉碱，神经酰胺等）