微生物代谢组学及其应用的研究进展_朱来宽

物 , 基因和蛋白表达的微小变化可以在代谢物上得 到放大 , 因此代谢组学技术对理解细胞功能来讲是 一种十分重要的功能基因组学技术 , 因为代谢组直 接反应了细胞的 生理状态 [ 2] , 利用代谢组 学技术 很有可能去发现细胞新的生化途径并解释其正常 的或病理的功能 [ 3] 。代谢组学技术在微生物研究 中的技术路线一般为 :生物标本采集 ※数据获取 ※ 数据分析 。本文对该路线中所涉及的方法及其在 微生物中的应用进行一综述 。
[ Keywords] metabolome;metabolomics;microbial [ ChineseJournalofConservativeDentistry, 2010, 20(1):51]
代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础 。 代谢组 [ 1] (Metabolome)是指某一组织或细胞在一 特定生理时期内所有低分子量的代谢产物 。 代谢 组学 (Metabolomics)是继基因组学 、转录组学 、蛋白 质组学之后系统生物学的另一重要组成部分 , 也是 目前组学领域研究的热点之一 。 细胞内的生命活 动大多发生于代谢层面 , 如细胞信号释放 、能量传 递 、细胞间通信等 , 代谢产物是基因表达的最终产
毛细 管 电 泳 -质谱 (Capillaryelectrophoresis coupledtomassspectrometry, CE-MS)在分析复杂 的代谢化合物上比 GC-MS、LC-MS更有潜在的优 势 , 包括高分辨效率 , 极小的样品量 (nL), 方法快 捷 , 较低的试剂消耗 。
OhashiY等 [ 17] 用 CE-MS对大肠杆菌的阴离 子 、阳离子代谢产物进行了综合和定量分析 。 在初 级代谢中 375种带电的亲水中间产物被鉴定 , 其中 的 198种被定量 , 进一步明确了 CE-MS能用于微 生物代谢领域 。
收稿日期 :2009 -11 -09 基金项目 :上海市科学技术委员会资助 (08DZ2271100)
上海市重点学科建设项目资助(S30206) 作者简介 :朱来宽(1979 -), 男, 河南人 。主治医师, 博士生(导师 :
梁景平) 通讯作者 :梁景平 , Tel:021 -63138341 -5201
GC-MS最主要的缺点是分析物必须为能挥发 的物质 。 由于大 部分代谢产物 是不能挥发的 , 因 此 , 需进行繁复的衍生化步骤是必须的 。 而且 , 热 不稳定的化合物如磷酸化代谢产物在 GC炉中接 触高温时容易降解 , 加之代谢产物对衍生剂有不同 的亲和力 , 使得定量分析不准确 , 必须使用标准化 的衍生化试剂和数据校正手段才能避免这种偏差 。 另外 , 衍生化过程中能出现副产品 , 而且分析物可 能会发生转变 (如精氨酸转为鸟氨酸 , 开链糖的成 环 )和 (或 )终产物的降解 (如三甲基硅烷基衍生物 的水解 ), 都会引起对所产生数据的误解 。 两步衍 生化方法 (如硅烷化后再甲肟化 )能提高待分析产 物的范围 。
2 数据获取
在细胞内代谢产物提取后紧接着就是如何对 这些提取物进行分辨 、鉴定和定量分析以获取原始 数据 。酶分析法虽然特异性高 , 但是其所需样品体 积多 , 而且一次只能分析一种物质 。随着色谱技术 和质谱技术的发展 , 从小体积样品中同时分析多种 代谢产物成为了可能 。 目前应用比较多的方法有 以下几种 [ 14] 。 2.1 气相色谱 -质谱在代谢组学中的应用
[ Abstract] Metabolomicsisthenewformedoffspringofbiologybesidesgenomics, transcriptomicsandprotomics.Itisanimportantpartoffunctionalgenomics.Metabolomicsoffersgreatpotentialforuncoveringnovelbiochemicalpathwaysandilluminatingnormalandpathologicalfunctionthroughseperationandquantitativeanalysisofmetabolitesofcell.Successfuldevelopmentofmetabolomicsrequirestechnologiesthatrapidlydetect, identifyandquantify multiplemetabolites.Thisisareviewaboutmicrobialmetabolomicsandits'applications.
1 生物标本采集
研究特定条件下培养的细菌的代谢组 , 首先要 对菌体样品进行采集 , 采集菌体细胞内的代谢产物 先要终止其代谢 过程即淬火 (quenching), 然后提
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取 (extraction)胞内代谢产物 。 1.1 淬火
淬火的方法一般有 :①用超滤性膜快速过滤后 立即冰冻 细胞 [ 4] ;②用高氯 酸稀释 细胞 [ 5] ;③在 -45 ℃甲醇溶液中稀释细胞 [ 6] ;④培养基置入液 氮快速冷冻 、解冻 、离心收集细 胞[ 7] ;⑤用带有预 冷 的不 锈钢 珠 的注 射 器迅 速 取样 、过滤 收集 细 胞 [ 7] 。在这些 方法中 , 甲醇淬火液易 导致严重的 代谢物渗漏 , 不适用于精确测定细胞内代谢产物的 水平 ;而快速过滤则能获得高水平的代谢产物 、氨 基酸并阻止三羧酸循环中间产物的逆转 , 能很好地 反映细胞 内代 谢产物 的水 平[ 8] ;Mashego等 [ 7] 报 道 :用液氮快速冷冻的方法定量分析代谢产物亦不 可靠 , 而用带有预冷的 不锈钢珠的注 射器迅速取 样 、过滤收集细胞的方法相对比较适合定量分析代 谢产物 。 1.2 提取
目前提取细胞内代谢产物的方法有 :①在乙醇 缓冲液中煮沸细胞随后在旋转蒸发器中脱水 [ 10] ; ②用高氯酸提取[ 5] ;③ -45 ℃甲醇提取[ 6] 。 高氯 酸提取 容易导 致大多 数代 谢产物 量的 减少 或缺 失 [ 11] , 而冷的甲醇可以同时用来进行淬火和提取 胞内代谢产物 , 且不导致有挥发性的代谢产物如丙 酮酸蒸 发掉 , 是首 选的 提取方 法 [ 12] 。 但是 Rabinowitz等[ 13] 最近研究发现冷的甲醇 -水 (50 ∶50) 液能使三磷酸核苷酸显著降解 , 导致三磷酸的丢失 从而 引起磷酸 化的核苷 酸衍生物 (如磷酸盐 、核 苷 、碱基 )的丢失 , 影响对代谢组的研究 , 进而错估 细胞内的能荷 ;实验中发现酸性乙腈液能使三磷酸 根的降解达到最小 , 减少高能代谢物的丢失及其向 低能衍生物的转化 , 从而提高代谢物的提取量 , 因 此乙腈 -甲醇 -水 -液是提取代谢物的首选 。
代谢组学的分析需要通过特定的试剂把某一
组织或细胞在一特定生理时期内所有低分子量的 代谢产物提取 (extraction)出来 。 最佳的提取方法 应该包括以下 几点[ 9] :①最大限度地 提取代谢产 物 ;②对有特殊物理或化学特性的分子无特异性和 吸附性 ;③不通过物理或化学方式破坏或修饰代谢 产物 。
由于生物样品复杂的性质而要求有效的分离 操作和改良的仪器 , 从而导致了多维分离仪器的产 生 , 如 GC-GCtimeofflight(TOF)-MS(全二维气相 色谱 /飞行时间质谱 )技术 。 这种新方法呈现出很
牙体牙髓牙周病学杂 志 (ChinJConservDent)2010, 20(1)
[ 关键词 ] 代谢组 ;代谢组学 ;微生物 [ 中图分类号 ] R780.2 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] 1005 -2593(2010)01 -0051 -05 [ 牙体牙髓牙周病学杂志 , 2010, 20(1):51]
Recentdevelopmentofmicrobialmetabolomicsandits′applications
DO I :10.15956/j .cnki .chin.j .conse rv .dent .2010.01.015
牙体牙髓牙周病学杂 志 (ChinJConservDent)2010, 20(1)
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微生物代谢组学及其应用的研究进展
朱来宽 1, 2 综述 ;梁景平1 审校 (1.上海交通大学医学院附属第九人民医院 ·市口腔医学重点实验室 , 上海 200011;
ZHULai-kuan＊ , LIANGJing-ping (＊ TheNinthPeople′sHospital, SchoolofMedicine, ShanghaiJiaoTongUniversity,
ShanghaiKeyLaboratoryofStomatology, Shanghai200011wk.baidu.com China)
2.吉林大学口腔医学院 , 吉林 长春 130041)
[ 摘 要 ] 代谢组学是继基因组学 、转录 组学 、蛋白质 组学之 后系统 生物学 中形成 的另一重 要组 成部 分 , 也是目前组学领域研究的热 点之一 。 代谢组学技术对理解细 胞功能来 讲是一种 十分重 要的功 能基因 组学 技术 , 因为代谢组直接反应了细 胞的生理状态 , 利用代谢组学技术很有可能去发现细 胞新的生化途径并解 释其 正常的或病理的功能 。 该文就代谢组学所涉及的技术及其在微生物领域的应用进行 综述 。
高的峰分辨能力并增加了敏感性 , 而 TOF-MS对改 良检测提供了非常快的扫 描率和额外的 敏感性 。 而且 , 两个不同 GC柱 (如极性或非极性 )的使用通 过选择性的改善为代谢组学分析提供了更大的产 物分析范围 。 2.2 液相色谱 -质谱在代谢组学的应用
液相色谱 -质 谱 (Liquidchromatographycoupledtomassspectrometry, LC-MS)作为一种独立的 技术 , 在分析代谢产物时有显著的优点 , 这不仅因 为不必衍生化分析物 , 而且还具有能分辨大量代谢 物的能力 。 LC分离与电喷雾 (ESI)联用 , 能使大 部分代谢产物被极化和电离以更加利于鉴别 。 此 外 , 还能通过离子配对 (IP)LC-MS、亲水作用液相 色谱 (HILIC)MS和反相 LC-MS技术从固定相到 流动相同时定量分析不同类型的代谢产物 。 因而 LC比 GC应用范围更广 。
GC-MS分离技术的优点是高分离效率 (其亮 点是能分 辨同质 异构体 )、易 用 、耐 用和 低成 本 。 GC-MS由于高标准化地应用了电子电离 , 能产生 广泛的和高重复性的破裂片段 , 这使得能够通过配 合代谢产物的相对保留时间 、滞留指数 、质谱裂解 谱 、已知的可预言的来自数据库的信息去鉴定代谢 产物 。
适当的取样是代谢组学技术精确和有效的关 键 , 通常的取样技术能引起细胞内代谢产物水平出 现误差 。抑制代谢物渗漏的影响 、减少取样时间的 影响 、数据的有效性检查均需进一步改进 。不同取
牙体牙髓牙周病学杂志 (ChinJConservDent)2010, 20(1)
样方法联用是覆盖微生物细胞内代谢物范围的最 佳方法 。
气相色谱 -质 谱 (Gaschromatographycoupled tomassspectrometry, GC-MS)在代谢组学研究中是 很受欢迎的工具 。 大多数 GC-MS代谢产物分析 用于植物代谢组学而不是微生物和生物医学的研 究 。但是 , 随着代谢工程领域的快速发展和分析技 术的新进展使得 GC-MS在微生 物代谢组学的应 用越来越多 。
BrauerMJ等 [ 15] 用 HILIC-MS测得大肠杆菌和 酿酒酵母菌饥饿应急反应的代谢图谱 , 在碳或氮源 供断情况下 , 测到 68 种代谢产物的浓度发生了变 化 。 WuL等[ 16] 用同位素标记酿酒酵母菌提取物 作为内参 , 用 LC-ESI-MS-MS测定了酿酒酵母菌 在葡萄糖刺激下的糖酵解和三羧酸循环的中间产 物的浓度 。 LC-MS因其对样品预处理要求简单 、 检测物质的范围更广等优势 , 因而在代谢组学领域 的应用和发展也越来越快 。 2.3 毛细管电泳 -质谱在代谢组学上的应用