第八章吸光光度法
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吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类
Ak1b
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
1852年；比尔： 阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关 系.
Ak2c
由比尔将二者结合起来,就得到布格-朗伯-比尔定 律,一般叫做朗伯-比尔定律.
AKbc
2、朗伯-比尔定律 的推导〔数学表达 式〕<略〕
3、灵敏度的表示方法
<1>吸收系数a〔吸光系数a 〕 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c以
§8-4 吸光光度法分析条件的选择
在光度分析中,一般需先选择适当的试剂与试样中的 待测组分反应使之生成有色化合物,然后再进行测定.
因此,分析条件的选择包括反应条件和测量条件的选 择.
一、显色反应及其条件的选择 〔一〕显色反应和显色剂 1、概念：
显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称 为显色反应. M + R = MR
这种方法简便、快速,对于解离度小的络合物,可 以得到满意的结果.
2、等摩尔连续变化法
此 法 的 做 法 是 保 持 CM 和 CR 的 浓度保持不变,即CM + CR = 常数, 连续改变CM和CR的比值,在选定 的仪器条件和波长下测定溶液的 吸光度A.
以A对CM/CR +CM作图.
等摩尔连续变化法测定络合物组成
g·L-1为单位时,K用a表示,称为吸收系数,其单位为 L·g-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表示为
A=abc
<2>摩尔吸光系数ε 当液层厚度b以cm为单位、吸光物质的浓度c
以mol·L-1为单位时,K用ε表示,称为摩尔吸收系 数,其单位为L·mol-1·cm-1.此时朗伯-比尔定律表 示为
A= εbc
二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择
光度法的误差除各种化学因素外,还有因仪器精度 不够,测量不准所带来的误差.
吸光度和透过率
纤维光度计
将光度计放入样品中, 原位测量. 对环境和 过程监测非常重要.
吸光度和透过率
34
纤维光度计示意图
镀铝反射镜
吸光度和透过率
35
纤维光度计
吸光度和透过率
36
吸光度和透过率
37
M2
出 射 狭 缝
29
检测器
h
Au，Ag
Ag、Au
半导体 Se
硒光电池
吸光度和透过率
30
光电管
h
Ni环（片）
碱金属 光敏阴极
红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm
吸光度和透过率
31
光电倍增管 160-700 nm
待扫描
1个光电子可产生106～107个电子
吸光度和透过率
32
溶剂、试剂对光的吸收等。
吸光度和透过率
21
8.2 光度分析的方法和仪器
8.2.1 光度分析的几种方法
1.目视比色法
观察方向
c1
c2
c3
c4
cc12
c3
c4
方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。
吸光度和透过率
22
2. 光电比色法
通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)
灵敏度和准 确度较差
光电比色计结构示意图
白光 入射狭缝 准直透镜
λ1
棱镜
λ2
聚焦透镜 出射狭缝
800 600 500
400
吸光度和透过率
28
光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度
等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。
原理： 利用光通过光栅时
平面透 射光栅
将光度计放入样品中, 原位测量. 对环境和 过程监测非常重要.
吸光度和透过率
34
纤维光度计示意图
镀铝反射镜
吸光度和透过率
35
纤维光度计
吸光度和透过率
36
吸光度和透过率
37
M2
出 射 狭 缝
29
检测器
h
Au，Ag
Ag、Au
半导体 Se
硒光电池
吸光度和透过率
30
光电管
h
Ni环（片）
碱金属 光敏阴极
红敏管 625-1000 nm 蓝敏管 200-625 nm
吸光度和透过率
31
光电倍增管 160-700 nm
待扫描
1个光电子可产生106～107个电子
吸光度和透过率
32
溶剂、试剂对光的吸收等。
吸光度和透过率
21
8.2 光度分析的方法和仪器
8.2.1 光度分析的几种方法
1.目视比色法
观察方向
c1
c2
c3
c4
cc12
c3
c4
方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。
吸光度和透过率
22
2. 光电比色法
通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)
灵敏度和准 确度较差
光电比色计结构示意图
白光 入射狭缝 准直透镜
λ1
棱镜
λ2
聚焦透镜 出射狭缝
800 600 500
400
吸光度和透过率
28
光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度
等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。
原理： 利用光通过光栅时
平面透 射光栅
第八章吸光光度法
仪器分析
分离：色谱技术和毛细 管电泳 定性或定量：利用物质 原子、分子、离子等的 特性， 如光吸收和发射 、电导、电位、质荷比 、荧光 结构、形态、状态分析 及表征
定量分析
化学分析
容量分析
c 标 准 V标 准 c 待 测 V待 测 a b
M待测 重量分析 m称量 w待测 M称量 ms
仪器分析
S k c a （a可为任意数值）
S k lgc a
常量组分，准确度高
微量、痕量组分，准确 度较化学法差，而且不 同方法之间差别较大
仪器分析方法的分类
光学分析法
电化学分析法 色谱分析法（分离分析方法） 热分析法 其它分析方法（质谱法、中子活化分析等）
联用技术
光学分析法
分光光度计
基本部件
光源 单色器 吸收池 检测系统
稳压电源
棱镜 光栅
紫外：氘灯
可见：碘钨灯 紫外可见：氙灯
吸光度具有加合性，即体系总的吸光度等于各组份吸光 度之和（设各吸光物质之间没有互相作用）。
A总=A1+A2+……..An = ε 1bc1+ ε 2bc2+……. ε nbcn
在吸光度的测量中，有时也用透光率或透光度表示物质对光 的吸收程度。透光率以T表示: T=I/I0 , 则吸光度与透光率之 间的关系为A=lgI0/I=lg1/T 。 2、偏离朗伯-比耳定律的原因 根据朗伯-比耳定律，当吸收池厚度保持不变，以吸光度 对浓度作图时，应得到一条通过坐标原点的直线，该直线称 为标准曲线或工作曲线。在相同条件下测得试液的吸光度， 从工作曲线上就可以查得试液的浓度。但在实际工作中，常 常遇到偏离线性关系的现象，特别是在溶液浓度较高时，常 会出现标准曲线向上或向下弯曲产生正偏离或负偏离（p241, 图9-4）。
第8章吸光光度法
MR + H+
显然，增大酸度对显色 反应不利。 ⑴影响显色剂浓度和颜色； ⑵影响Mn+的存在状态;
⑶影响配合物的组成。
实际工作中，作 A ～ pH 曲线，寻找适宜 pH 范围。
A
pH
3、显色温度的选择： 一般在室温，有时需加热，通过实验确定
4、显色反应时间：制作吸光度-时间曲线
(c(M)、 c(R) 、 pH一定)
一、显色反应的选择：
1、显色反应的类型：配位反应和氧化还原反应。 2、对显色反应的要求： ⑴灵敏度足够高:κ＞105 超高灵敏，κ=(6~10)104 高灵敏,κ=(2~6)104中等，κ＜2×104不灵敏 ⑵显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空白小。 对比度：两有色物质最大吸收波长之差 Δλ=|λMAXMR-λMAXR|≥60nm
2、吸收曲线：测量某 种物质对不同波长单色 光的吸收程度，以波长 为横坐标，吸光度为纵 坐标，得到的一条吸收 光谱曲线。
（1）用途： ①进行定性分析； ②进行定量分析； ③选择吸收波长； ④判断干扰情况。
9
定性分析与定量分析的基础
不同物质吸收光谱的形状以及max 不同
B 定性分析基础 物质对光的选择 吸收
练习题
1、人眼能感觉到的光称为可见光，其波长范围 是 A。400~780nm B。200~320nm C。200~780nm D。200~1000nm 答案： A 2 、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大 时，最大吸收波长和吸光度分别是 A。不变，增加 B。不变，减少 C。增加，不变 D。减少，不变 答案： A
Ia
透光率 （透射比）Transmittance
8吸光光度法
四、显色反应和显色条件的选择
(2) 显色溶液的pH值
例： pH=1.8~2.5
Fe(ssal)+ 紫红色
pH=4~8
Fe(ssal)-2 橙红色
pH=8~11.5
Fe(ssal) 3 3- 黄色
常用的光源 :
可见光区: 钨灯 (辐射波长为320nm~2500nm) 紫外区: 氢灯、氘灯(辐射波长为185nm~400nm)
31
三. 仪器和方法
＊ 单色器（滤光片、棱镜或光栅）
作用 :
将光源发射的复合光分解成单色光的光学系统
1. 滤光片----光电比色计的单色器
组成：由有色玻璃制成
作用：只允许和它颜色相同的光通过，得 到的是近似的单色光
选择的原则：滤光片最易通过的光是有色溶液
最易吸收的光
互补色
32
三. 仪器和方法 2. 棱镜或光栅
----分光光度计的单色器
由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成
组成 :
入射狭缝：光源的光由此进入单色器
准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束
色散元件：将复合光分解成单色光
聚焦装置：将分光后的单色光聚焦至出射狭缝
（透镜或凹面镜）
33
三. 仪器和方法 ＊ 样品室（石英池和玻璃池） 用于放置各种类型的吸收池(比色皿)和相 应的池架附件
石英或玻璃池，紫外区一定要用石英池
厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, …cm
36
三. 仪器和方法
＊检测系统 光电管或光电倍增管
将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。 要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，
17
二 . 吸光光度法的基本原理
吸光光度法 PPT
为透射比或透光度,用T表示溶液的透射 比愈大,表示它对光的吸收愈小;相反,透 射比愈小,表示它对光的吸收愈大。
T It I0
朗伯(Lambert J H)与比尔(Beer A)分别于 1760与1852年研究了光的吸收与溶液层的厚 度及溶液浓度的定量关系,二者结合称为朗伯比尔定律,也称为光的吸收定律。
光栅(grating)是依照光的衍射与干涉原理将复 合光色散为不同波长的单色光,然后再让所需波 长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率 比棱镜大,可用的波长范围也较宽。
3、吸收系统——比色皿或吸收池
用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐 蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的,按 其厚度分为0、5cm,lcm,2cm,3cm与5cm。
• 偏离朗伯－比尔定律的原
因主要是仪器或溶液的实际
条件与朗伯—比尔定律所要
求的理想条件不一致。
1、物理因素
(1)非单色光引起的偏离
* 朗伯-比尔定律只适用于单色光,但由于单色器
色散能力的限制与出口狭缝需要保持一定的宽度, 因此目前各种分光光度计得到的入射光实际上都 是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长 光的吸收程度的不同,因而导致对朗伯－比尔定ຫໍສະໝຸດ * 分子吸收光谱 -带状光谱
molecular absorption spectrum →由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差
在1~20(eV)],为紫外及可见分光光度法。
UV/Vis Spectrophotometry →由分子振动能级(能量差约0、05~l eV)与
转动能级(能量差小于0、05 eV)的跃迁而 产生的吸收光谱,为红外吸收光谱。用于 分子结构的研究。
B 络合:显色剂与金属离子生成的是多级络合物,且各 级络合物对光的吸收性质不同,例如在Fe(Ⅲ) 与 SCN-的络合物中,Fe(SCN)3颜色最深,Fe(SCN)2+颜 色最浅,故SCN-浓度越大,溶液颜色越深,即吸光度 越大。
T It I0
朗伯(Lambert J H)与比尔(Beer A)分别于 1760与1852年研究了光的吸收与溶液层的厚 度及溶液浓度的定量关系,二者结合称为朗伯比尔定律,也称为光的吸收定律。
光栅(grating)是依照光的衍射与干涉原理将复 合光色散为不同波长的单色光,然后再让所需波 长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率 比棱镜大,可用的波长范围也较宽。
3、吸收系统——比色皿或吸收池
用于盛放试液的容器。它是由无色透明、耐腐 蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的,按 其厚度分为0、5cm,lcm,2cm,3cm与5cm。
• 偏离朗伯－比尔定律的原
因主要是仪器或溶液的实际
条件与朗伯—比尔定律所要
求的理想条件不一致。
1、物理因素
(1)非单色光引起的偏离
* 朗伯-比尔定律只适用于单色光,但由于单色器
色散能力的限制与出口狭缝需要保持一定的宽度, 因此目前各种分光光度计得到的入射光实际上都 是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长 光的吸收程度的不同,因而导致对朗伯－比尔定ຫໍສະໝຸດ * 分子吸收光谱 -带状光谱
molecular absorption spectrum →由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差
在1~20(eV)],为紫外及可见分光光度法。
UV/Vis Spectrophotometry →由分子振动能级(能量差约0、05~l eV)与
转动能级(能量差小于0、05 eV)的跃迁而 产生的吸收光谱,为红外吸收光谱。用于 分子结构的研究。
B 络合:显色剂与金属离子生成的是多级络合物,且各 级络合物对光的吸收性质不同,例如在Fe(Ⅲ) 与 SCN-的络合物中,Fe(SCN)3颜色最深,Fe(SCN)2+颜 色最浅,故SCN-浓度越大,溶液颜色越深,即吸光度 越大。
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
吸光光度法(职高)
Ⅳ-3
吸光光度法
一、吸光光度法的分析原理 1、溶液的颜色对光的选择性吸收 光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。不同波长(或 频率)的光，能量不同，短波的能量大，长波的能量小。 波长、频率与速度之间的关系为：E=hν =hc/ λ h为普朗克常数，其值为6.63×10-34J·s
10-2 nm 10 nm
电 磁 波 谱
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
无 线 电 波
105 cm
可 见
光
近紫外：200-400nm 人眼所能感觉到的波长范围400-750nm 近红外：750－2500nm 可见光 色散
红 橙 黄 绿 青 青蓝 蓝 紫
650-750 600-650 580-600
500-580 490-500
480-490 450-480
400-450
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
概念： 单色光: 同一波长的光 复合光: 由不同波长的光组合而成的光，即白光
波长在400～750nm范围内，称为可见光。
光的互补:若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光， 这种现象称为光的互补。 物质选择性地吸收白光中某种颜色的光，物质就会呈 现其互补色光的颜色。 溶液颜色的深浅，取决于溶液中吸光物质浓度的高低。
对固体物质来说，当白光照射到物 质上时，物质对于不同波长的光线 吸收、透过、反射、折射的程度不 同而使物质呈现出不同的颜色。如 果物质对各种波长的光完全吸收， 则呈现黑色；如果完全反射，则呈 现白色；如果对各种波长的光吸收 程度差不多，则呈现灰色；如果物 质选择性地吸收某些波长的光，那 么，这种物质的颜色就由它所反射 或透过光的颜色来决定。
吸光光度法
一、吸光光度法的分析原理 1、溶液的颜色对光的选择性吸收 光是一种电磁波，具有波动性和粒子性。不同波长(或 频率)的光，能量不同，短波的能量大，长波的能量小。 波长、频率与速度之间的关系为：E=hν =hc/ λ h为普朗克常数，其值为6.63×10-34J·s
10-2 nm 10 nm
电 磁 波 谱
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
无 线 电 波
105 cm
可 见
光
近紫外：200-400nm 人眼所能感觉到的波长范围400-750nm 近红外：750－2500nm 可见光 色散
红 橙 黄 绿 青 青蓝 蓝 紫
650-750 600-650 580-600
500-580 490-500
480-490 450-480
400-450
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
nm
概念： 单色光: 同一波长的光 复合光: 由不同波长的光组合而成的光，即白光
波长在400～750nm范围内，称为可见光。
光的互补:若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光， 这种现象称为光的互补。 物质选择性地吸收白光中某种颜色的光，物质就会呈 现其互补色光的颜色。 溶液颜色的深浅，取决于溶液中吸光物质浓度的高低。
对固体物质来说，当白光照射到物 质上时，物质对于不同波长的光线 吸收、透过、反射、折射的程度不 同而使物质呈现出不同的颜色。如 果物质对各种波长的光完全吸收， 则呈现黑色；如果完全反射，则呈 现白色；如果对各种波长的光吸收 程度差不多，则呈现灰色；如果物 质选择性地吸收某些波长的光，那 么，这种物质的颜色就由它所反射 或透过光的颜色来决定。
第八章 吸光光度法
第四节 吸光度测量条件的选择
一、入射光波长的选择
吸收大，灵敏度高 1、原则： 对朗伯-比尔定律偏离小 一般选λ max处 如有干扰，要避开。 “吸收最大，干扰最小”。
选500nm进行测定 选520nm进行测定
2013-7-14
二、参比溶液的选择 显色剂、其他试剂均无色时 用蒸馏水作参比； 显色剂有色、其他试剂无色时 用同样浓度的显色剂作参比； 显色剂无色、其他试剂有色时 用其他试剂作参比； 显色剂、其他试剂均有色时 用不加待测离子的试剂和显色剂混合溶液作参比。
二、光吸收的基本定律（朗伯-比尔定律） 1、透光率和吸光度 透光率 T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 % 吸光度 A lg T A 取值为0 ~ +∞ 全部吸收 A = + ∞
2013-7-14
全部透射
A=0
2、朗伯-比尔定律 当单色光通过均匀的溶液 时，吸光度与溶液的浓度 和液层的厚度成正比。 表示为：A=Kbc A——吸光度 光度法定 K——比例常数 量的依据 b——液层厚度，比色皿 厚度 c——溶液浓度 单色光 2013-7-14 均匀溶液
2013-7-14
2、单色器
作用：将光源发出的复合光转变为所需波长的单色光。 分为棱镜和光栅两种。
2013-7-14
光栅的分辨率比棱镜大， 可用的波长范围也较宽。
3、吸收池（比色皿）
作用：用来盛放待测溶液。 光学玻璃制成的无色透明的长方体容器，规格 有0.5，1.0，2.0，5.0cm等。
2013-7-14
显色反应及显色条件的选择
将待测组分转变为有色化合物的反应。 与待测组分形成有色化合物的试剂。
8第八章 比色分析法
I
上式为朗伯-比尔定律的数学表示式。它表示一束 单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度 和液层厚度的乘积成正比。 医学化学
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式中，K为吸光系数，当溶液浓度c和液层厚度b 的数值均为1时，A=K，即吸光系数在数值上等 于c和b均为1时溶液的吸光度。对于同一物质和 一定波长的入射光而言，它是一个常数。
T 比色法中常把I/I0 称为透光度，用T表示，
def
透光度和吸光度的关系如下：
I I0
A =－lgT
医学化学
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当c以质量体积浓度（g· ml-1）表示时，吸光系数 称为质量吸光系数，用a表示。当c以mol· L-1为单 位时，吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示， 其单位是L· mol-1· cm-1。吸光系数越大，表示溶液 对入射光越容易吸收，当c有微小变化时就可使 A有较大的改变，故测定的灵敏度较高。一般ε 值在103以上即可进行比色分析。
医学化学
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用标准曲线法时，应注意的问题：
（1）标准液的测定和被测液的测定应在相同条件 下进行。 • （2）溶液的浓度应在标准曲线的线性范围内。
•
医学化学
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在测定溶液吸光度时，为了消除与被测物质吸收 无关的因素的影响，如溶剂或其他物质对入射光 的吸收，光在溶液中的散射以及吸收池界面对光 的反射等，必须采用空白溶液（又称参比溶液） 作对照。常用的空白溶液有三种： （1）溶剂空白 （2）试剂空白 （3）试样空白 P85
则
c = -lg65%/2235×2.0=4.19×10-5(mol· L-1)
上式为朗伯-比尔定律的数学表示式。它表示一束 单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度 和液层厚度的乘积成正比。 医学化学
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式中，K为吸光系数，当溶液浓度c和液层厚度b 的数值均为1时，A=K，即吸光系数在数值上等 于c和b均为1时溶液的吸光度。对于同一物质和 一定波长的入射光而言，它是一个常数。
T 比色法中常把I/I0 称为透光度，用T表示，
def
透光度和吸光度的关系如下：
I I0
A =－lgT
医学化学
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当c以质量体积浓度（g· ml-1）表示时，吸光系数 称为质量吸光系数，用a表示。当c以mol· L-1为单 位时，吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示， 其单位是L· mol-1· cm-1。吸光系数越大，表示溶液 对入射光越容易吸收，当c有微小变化时就可使 A有较大的改变，故测定的灵敏度较高。一般ε 值在103以上即可进行比色分析。
医学化学
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用标准曲线法时，应注意的问题：
（1）标准液的测定和被测液的测定应在相同条件 下进行。 • （2）溶液的浓度应在标准曲线的线性范围内。
•
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在测定溶液吸光度时，为了消除与被测物质吸收 无关的因素的影响，如溶剂或其他物质对入射光 的吸收，光在溶液中的散射以及吸收池界面对光 的反射等，必须采用空白溶液（又称参比溶液） 作对照。常用的空白溶液有三种： （1）溶剂空白 （2）试剂空白 （3）试样空白 P85
则
c = -lg65%/2235×2.0=4.19×10-5(mol· L-1)
第八章 原子吸收光谱
12:19:39
（3）火焰
试样雾滴在火焰中，经蒸发，干燥，离解等过程产生大 量基态原子。
火焰温度的选择：
只要保证待测元素充分离解为基态原子就可以，超过所需 温度，使激发态原子增加；
（a）确保待测元素充分离解为基态原子的前提下，选用低 温火焰
（b）火焰温度取决于燃气与助燃气类型。(表8-3)
12:19:39
温
度
虚线：阶梯升温
oC
实线：斜坡升温
干燥
灰化
原子化 净化
时间，t
干 燥：去除溶剂，防样品溅射； 灰 化：使易挥发的基体和有机物尽量除去； 原子化：待测物化合物分解为基态原子 净 化：样品测定完成，高温去残渣，净化石墨管。
12:19:39
（3）石墨管原子化器的优缺点
优点：原子化程度高，试样用量少 缺点：背景干扰比火焰法大，精密度差（自动进样装置）
或由标准试样数据获得线性方程，将测定试样的吸光度A
数据带入计算。
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2.标准加入法 取若干份体积相同的试液（cX），依次按比例加入不同
量的待测物的标准溶液（cO），定容后浓度依次为： cX ， cX +cO ， cX +2cO ， cX +3cO ， cX +4 cO ……
分别测得吸光度为：AX，A1，A2，A3，A4……。 以A对加入量做图得一直线，图中cX点即待测溶液浓度 。
2 π ln 2 e2
A 0.434 D mc N0 fL kLN0 当使用锐线光源时，吸光度与原子蒸汽中待测元素的 基态原子数成正比 A kLN0
12:19:39
火焰温度低于3000K时，可以用基态原子数代表待测元 素的原子总数
当使用锐线光源时，A = k N0 L =k’ c （比尔定律）
（3）火焰
试样雾滴在火焰中，经蒸发，干燥，离解等过程产生大 量基态原子。
火焰温度的选择：
只要保证待测元素充分离解为基态原子就可以，超过所需 温度，使激发态原子增加；
（a）确保待测元素充分离解为基态原子的前提下，选用低 温火焰
（b）火焰温度取决于燃气与助燃气类型。(表8-3)
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温
度
虚线：阶梯升温
oC
实线：斜坡升温
干燥
灰化
原子化 净化
时间，t
干 燥：去除溶剂，防样品溅射； 灰 化：使易挥发的基体和有机物尽量除去； 原子化：待测物化合物分解为基态原子 净 化：样品测定完成，高温去残渣，净化石墨管。
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（3）石墨管原子化器的优缺点
优点：原子化程度高，试样用量少 缺点：背景干扰比火焰法大，精密度差（自动进样装置）
或由标准试样数据获得线性方程，将测定试样的吸光度A
数据带入计算。
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2.标准加入法 取若干份体积相同的试液（cX），依次按比例加入不同
量的待测物的标准溶液（cO），定容后浓度依次为： cX ， cX +cO ， cX +2cO ， cX +3cO ， cX +4 cO ……
分别测得吸光度为：AX，A1，A2，A3，A4……。 以A对加入量做图得一直线，图中cX点即待测溶液浓度 。
2 π ln 2 e2
A 0.434 D mc N0 fL kLN0 当使用锐线光源时，吸光度与原子蒸汽中待测元素的 基态原子数成正比 A kLN0
12:19:39
火焰温度低于3000K时，可以用基态原子数代表待测元 素的原子总数
当使用锐线光源时，A = k N0 L =k’ c （比尔定律）
8章吸光光度法
2019/10/20
光学光谱区
远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外
（真空紫外）
远红外
10nm~200nm 200nm 400nm
780 nm 2.5 m 50 m
~400nm ~ 780nm ~ 2.5 m ~ 50 m ~300 m
2019/10/20
三、物质对光的选择性吸收
单色光：具有相同能量(相同波长)的光. 复合光：具有不同能量(不同波长)的光复合 在一起. 例如白光. 互补光：把两种适当颜色的光按一定的强度
2019/10/20
吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏 离
质点间的静电作用 质点的散射 质点间的化学反应
2019/10/20
2.散射 试样不均匀,被测液含悬浮物或胶粒等散射指
点时,入射光因散射而损失。 3.化学因素
溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合 物的形成等化学平衡破坏了平衡浓度分析浓度的 正比关系，造成对朗伯—比耳定律的偏离。
2019/10/20
吸收曲线的讨论：
（1）不同物质,曲线形状 不同，最大吸收波长λmax 不同，可用作定性鉴定各 种物质
（2）同一种物质，浓度 不同，其吸收曲线形状相 似，λmax不变。
2019/10/20
（3）同一种物质，浓度不同，在某一定波长下吸光 度 A 有差异，在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最 大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择 入射光波长的重要依据。
2019/10/20
8.2 光度计及基本部件
1.目视比色法
观察方向
空白 c1
c2
c3
c4
方便、灵敏，准确度差. 常用于限界分析.
2019/10/20
目视比色法 特点
仪器分析课后习题第八章答案
在仪器设备上，二者非常相似，不同之处在于原子吸收光谱仪中所有组 件排列在一条直线上，而荧光光谱仪则将光源与其它组件垂直排列，以 消除激发光源发射的辐射对检测信号的影响。
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12.用波长为213.8nm,质量浓度为0.010mg.mL-1的锌标准溶 液和空白溶液交替连续测定10次,用记录仪记录的格数如下. 计算该原子吸收分光光度计测定锌元素的检出限.
3．在原子吸收光度计中为什么不采用连续光源（如钨丝灯或氘灯）， 而在分光光度计中则需要采用连续光源？
解：虽然原子吸收光谱中积分吸收与样品浓度呈线性关系，但由于原子 吸收线的半宽度很小，如果采用连续光源，要测定半宽度很小的吸收线 的积分吸收值就需要分辨率非常高的单色器，目前的技术条件尚达不到， 因此只能借助锐线光源，利用峰值吸收来代替．
9．应用原子吸收光谱法进行定量分析的依据是什么？进行定量分析有哪些方法？ 试比较它们的优缺点． 解：在一定的浓度范围和一定的火焰宽度条件下，当采用锐线光源时，溶液 的吸光度与待测元素浓度成正比关系，这就是原子吸收光谱定量分析的依据。 常用两种方法进行定量分析： （１）标准曲线法：该方法简便、快速，但仅适用于组成简单的试样。 （２）标准加入法：本方法适用于试样的确切组分未知的情况。不适合于曲 线斜率度，应注意那些问题？怎样 选择原子吸收光谱分析的最佳条件？ 解：应该从分析线的选择、光源（空心阴极灯）的工作电流、火焰的 选择、燃烧器高度的选择及狭缝宽度等几个方面来考虑，选择最佳的 测定条件。
11．从工作原理、仪器设备上对原子吸收法及原子荧光法作比较。 解：从工作原理上看，原子吸收是通过测定待测元素的原子蒸气对其特 征谱线的吸收来实现测定的，属于吸收光谱，而原子荧光则是通过测量 待测元素的原子蒸气在辐射能激发下所产生的荧光的强度来实现测定的， 属于发射光谱。
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12.用波长为213.8nm,质量浓度为0.010mg.mL-1的锌标准溶 液和空白溶液交替连续测定10次,用记录仪记录的格数如下. 计算该原子吸收分光光度计测定锌元素的检出限.
3．在原子吸收光度计中为什么不采用连续光源（如钨丝灯或氘灯）， 而在分光光度计中则需要采用连续光源？
解：虽然原子吸收光谱中积分吸收与样品浓度呈线性关系，但由于原子 吸收线的半宽度很小，如果采用连续光源，要测定半宽度很小的吸收线 的积分吸收值就需要分辨率非常高的单色器，目前的技术条件尚达不到， 因此只能借助锐线光源，利用峰值吸收来代替．
9．应用原子吸收光谱法进行定量分析的依据是什么？进行定量分析有哪些方法？ 试比较它们的优缺点． 解：在一定的浓度范围和一定的火焰宽度条件下，当采用锐线光源时，溶液 的吸光度与待测元素浓度成正比关系，这就是原子吸收光谱定量分析的依据。 常用两种方法进行定量分析： （１）标准曲线法：该方法简便、快速，但仅适用于组成简单的试样。 （２）标准加入法：本方法适用于试样的确切组分未知的情况。不适合于曲 线斜率度，应注意那些问题？怎样 选择原子吸收光谱分析的最佳条件？ 解：应该从分析线的选择、光源（空心阴极灯）的工作电流、火焰的 选择、燃烧器高度的选择及狭缝宽度等几个方面来考虑，选择最佳的 测定条件。
11．从工作原理、仪器设备上对原子吸收法及原子荧光法作比较。 解：从工作原理上看，原子吸收是通过测定待测元素的原子蒸气对其特 征谱线的吸收来实现测定的，属于吸收光谱，而原子荧光则是通过测量 待测元素的原子蒸气在辐射能激发下所产生的荧光的强度来实现测定的， 属于发射光谱。
吸光光度法
It 透光度定义： T I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 全部透射 T = 0.0 % T = 100.0 % A=∞ A= 0.00
吸光度：A=lg (I0 / It )＝lg(1/T)
全部吸收
全部透射
朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比 比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比
2.介质不均匀引起的偏离 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测
吸光度增加，导致线性关系上弯曲
3.化学反应引起的偏离 离解、缔合、异构等 如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42PAR的偶氮－醌腙式
4 显色反应的干扰及其消除方法
1）优化显色反应条件，控制溶液的酸度 2）加入隐蔽剂 3）改变价态 4）选择适当波长 5）选择合适参比溶液
2)单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任 波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光
后所得单色光聚焦至
出射狭缝； ⑤出射狭缝。
16
单色器
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同
800
λ1
白光
600
500
λ2
入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝
400
17
光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度
等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。 原理： 利用光通过光栅时
平面透 射光栅 透 镜
光屏
M1
发生衍射和干涉现象而 分光.
吸光光度法的基本原理
吸光光度法的基本原理具体来说，吸光光度法使用的是一束单色光通过样品溶液后的光强的测量。
单色光通过样品中时，有一部分光被吸收，另一部分光透射通过样品。
被吸收的光子的数量与样品中的分子或离子的数量成正比。
根据比尔－朗伯定律，这一吸收过程的强度可以通过下式来表示：A = εlc其中，A表示吸光度，ε是摩尔吸光系数（也称为摩尔吸光度），l是样品溶液的光程，c是溶液中的物质浓度。
吸光度单位通常使用“摩尔吸光度/厘米”或“摩尔吸光度/毫升”来表示，而浓度单位则可以是摩尔/升、克/升或百分比等。
1.光源：吸光光度法通常使用单色光源，如钠灯、汞灯或LED。
选择不同波长的光源可以针对不同化学分析问题。
2.样品：经过光源的光束通过溶液中的样品，在其透射或吸收一定量的光线之后，进入光电器件进行检测。
3.检测：光电器件通常是一个光电二极管或光电倍增管，用来测量透射或吸收的光线强度。
通过比较样品溶液的吸光度与标准溶液的吸光度，可以计算出样品中的物质浓度。
在实际应用中，吸光光度法常用于分析药物、环境污染物、食品成分、金属离子浓度等。
通过选择适当的光源和光电检测装置，可以实现对特定化合物的高灵敏度和选择性分析。
需要注意的是，吸光光度法在实际应用中对于样品的准备和处理非常重要。
避免杂质的干扰和保证测量条件的准确性是确保吸光光度法测量结果准确性的关键。
此外，还需要合适的标准溶液来建立测量曲线和校准方法。
总之，吸光光度法是一种常用的分析方法，其基本原理是根据溶液中物质吸光的特性来测量溶液中物质的浓度。
通过光源和光电器件的选择，可以实现高灵敏度和选择性的分析。
在使用吸光光度法进行分析时，需要注意样品的准备和处理以及校准方法的建立，以确保测量结果的准确性。
《吸光光度法教案》课件
《吸光光度法教案》PPT课件第一章：引言1.1 吸光光度法的定义1.2 吸光光度法在分析化学中的应用1.3 吸光光度法的原理1.4 吸光光度法的仪器与操作步骤第二章：吸光光度法的原理2.1 光的吸收与发射2.2 朗伯-比尔定律2.3 摩尔吸光系数2.4 吸光度的计算与单位第三章：分光光度计的结构与操作3.1 分光光度计的组成部分3.2 分光光度计的操作步骤3.3 光谱仪的使用与维护3.4 波长的选择与调整第四章：标准曲线的制备与分析4.1 标准曲线的制备方法4.2 标准曲线的绘制与分析4.3 样品浓度的计算与误差分析4.4 实际案例分析：药物含量测定第五章：吸光光度法的应用5.1 环境监测中的应用5.2 生物化学中的应用5.3 食品分析中的应用5.4 临床诊断中的应用第六章：吸光光度法的准确度与精确度6.1 准确度的评估6.2 精确度的评估6.3 干扰因素及其影响6.4 提高吸光光度法准确度的方法第七章：溶液的制备与处理7.1 溶液的配制方法7.2 溶液的浓度与体积的计算7.3 样品的前处理与分离7.4 样品分析中的常见问题与解决方法第八章：光散射与吸光光度法8.1 光散射现象的介绍8.2 光散射对吸光光度法的影响8.3 光散射的测定与分析8.4 光散射在吸光光度法中的应用案例第九章：吸光光度法在药物分析中的应用9.1 药物分析中的重要性9.2 药物的紫外吸收特性9.3 药物含量测定的方法与步骤9.4 实际案例分析：药物制剂中主成分的测定第十章：现代吸光光度法技术进展10.1 光纤吸光光度法10.2 微透析吸光光度法10.3 激光吸光光度法10.4 在线监测与自动化分析技术第十一章：吸光光度法在有机合成中的应用11.1 有机化合物的紫外吸收特性11.2 有机合成中光催化反应的监控11.3 有机物含量的测定与分析11.4 实际案例分析：有机合成产物的纯度测定第十二章：吸光光度法在材料科学中的应用12.1 材料科学中的光吸收现象12.2 吸光光度法在材料合成与表征中的应用12.3 材料性能与吸光性质的关系研究12.4 实际案例分析：纳米材料粒径的测定第十三章：吸光光度法在生命科学中的应用13.1 生物大分子的紫外吸收特性13.2 蛋白质浓度与纯度的测定13.3 核酸的定量分析与监测13.4 实际案例分析：细胞培养中的营养物质监测第十四章：吸光光度法在环境监测中的应用14.1 环境污染物的紫外吸收特性14.2 水质分析与监测14.3 大气污染物分析与监测14.4 实际案例分析：水体中有机物的总量测定第十五章：实验与练习15.1 吸光光度法的基本实验操作15.2 标准曲线与样品分析的实验操作15.3 常见干扰因素的实验探究15.4 综合实验练习：饮料中维生素C含量的测定重点和难点解析重点：1. 吸光光度法的定义、原理及其在分析化学中的应用。
分析化学 第八章-分光光度法
差相等时才能发生吸收。
∆E = E2 − E1 = hν
不同的物质由于其结构不同而具有不同的量子 化能级，其能量差也不相同，物质对光的吸收 具有选择性。
16
吸收曲线（吸收光谱）： 测量溶液对不同波长光的吸收，以波长为横坐
标，吸光度为纵坐标作图，得到吸收曲线。 描述了物质对不同波长光的吸收能力。
吸收曲线
A ~ λ (nm) 最大吸收波长：λmax
17
同一浓度，不同物质 不同浓度，同一物质
18
吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。 （2）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物 质定性分析的依据之一。也是定量分析中选择入射 光波长的重要依据。 （3）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似。 在某一定波长下吸光度有差异，在λmax处吸光度的差 异最大，测定最灵敏，可用于物质定量分析。
3. 双波长型
λ1 λ2
通过波长选择可校正背景吸收：消除吸收光谱重 叠干扰，适合于混浊液和多组分分析。
只使用一个吸收池：参比溶液即被测溶液，避免 单波长法中因两种溶液组成、均匀性差异及吸收 池差异所引入的误差。
41
8.3 显色反应及显色条件的选择
1. 显色反应的选择 2. 显色剂 3. 显色条件的选择
吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；
不随浓度和光程长度的改变而改变。在温度和 波长等条件一定时，ε 仅与吸光物质本身的性质 有关；
可作为定性鉴定的参数；
同一吸光物质在不同波长下的ε不同。在λmax处 的ε常以εmax表示。εmax越大，该物质的吸光能力 越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。
分子内部三种 运动形式
电子相对于原子核的 运动
原子核在其平衡位置 附近的相对振动
∆E = E2 − E1 = hν
不同的物质由于其结构不同而具有不同的量子 化能级，其能量差也不相同，物质对光的吸收 具有选择性。
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吸收曲线（吸收光谱）： 测量溶液对不同波长光的吸收，以波长为横坐
标，吸光度为纵坐标作图，得到吸收曲线。 描述了物质对不同波长光的吸收能力。
吸收曲线
A ~ λ (nm) 最大吸收波长：λmax
17
同一浓度，不同物质 不同浓度，同一物质
18
吸收曲线的讨论：
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。 （2）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物 质定性分析的依据之一。也是定量分析中选择入射 光波长的重要依据。 （3）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似。 在某一定波长下吸光度有差异，在λmax处吸光度的差 异最大，测定最灵敏，可用于物质定量分析。
3. 双波长型
λ1 λ2
通过波长选择可校正背景吸收：消除吸收光谱重 叠干扰，适合于混浊液和多组分分析。
只使用一个吸收池：参比溶液即被测溶液，避免 单波长法中因两种溶液组成、均匀性差异及吸收 池差异所引入的误差。
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8.3 显色反应及显色条件的选择
1. 显色反应的选择 2. 显色剂 3. 显色条件的选择
吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；
不随浓度和光程长度的改变而改变。在温度和 波长等条件一定时，ε 仅与吸光物质本身的性质 有关；
可作为定性鉴定的参数；
同一吸光物质在不同波长下的ε不同。在λmax处 的ε常以εmax表示。εmax越大，该物质的吸光能力 越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。
分子内部三种 运动形式
电子相对于原子核的 运动
原子核在其平衡位置 附近的相对振动
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透过所需光谱范围内的光线。
（4）检测系统 检测器 将透射光信号转化为电信号进行测量的
装置。光电管（灵敏度高、不易疲劳）。 指示器 把放大的信号以适当的方式显示或记录
下来。和检测器一起组成检测系统。
8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度
灵敏度的表示-摩尔吸光系数ε
例 0.0880mg Fe3+在酸性溶液中，以硫氰酸钾显色 后，用水稀释到50.00ml，在480nm处用1cm比色皿 测得吸光度A为0.220，计算该显色反应的摩尔吸光 系数。
一般情况下选择被测溶液的最大吸收波长为入 射光波长。这样测定的灵敏度和准确度都较高。
如果干扰物质在最大吸收波长处有强烈的吸收， 则可选其它波长，但要注意尽可能选择值随波长改 变而变化不太大的范围内的波长。
最大吸收波长处有干扰时，可选择其它一 处合适的波长来测定。
参比溶液的选择
在吸光度测量中，将发生反射、吸收和透射等 作用，由于反射以及溶剂、试剂等对光的吸收会造 成透射光的减弱，为使光强度减弱仅与溶液中待测 物质的浓度有关，必须进行校正。
第八章 吸光光Biblioteka 法吸光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收而建 立的一种分析方法。 可见分光光度法——Visible Spectrophotometry
特点：灵敏度高，微量、痕 量组分（10-4-10-5%）；准确 度高，2%-5%。
知识点：
1 单色光 复合光 互补光 2 吸收曲线、标准曲线 3 吸光度、透光率及其关系 4 朗伯-比尔定律的应用（计算） 5 分光光度计的基本组成部件 6 吸光光度法的灵敏度-摩尔吸光系数及其计算 7 影响测定结果准确度的因素（了解） 8 显色反应和测定条件的选择（了解）
8.1 物质对光的选择性吸收
物质之所以呈现五彩缤纷的不同颜色，就是因为 选择性地吸收了某些特定波长的可见光所致。例 如：高锰酸钾为紫色；重铬酸钾为橙色。
有色溶液颜色的深浅，与有色物质的浓度成正比。
高锰酸钾溶液吸收曲线
高锰酸钾溶液浓度不 同，最大吸收波长不变， 都是525nm。 在最大吸收波长处测定 吸光度，灵敏度最高。
显色反应条件的选择
显色剂用量 反应体系的酸度 显色反应的温度 显色反应的时间 干扰的消除
①加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂 ②控制溶液酸度 ③选择适当的波长 ④选择适当的参比溶液。
（2）吸光度测量条件的选择 入射光波长的选择 入射光的波长根据吸收光谱选择，选择的原则
是吸收最大，干扰最小。
吸光度读数范围的选择
当 T = 0.368（A=0.434）时，浓度测定的相对误差 最小。
光电比色法是利用光电比色计测定溶液的吸光度 以进行定量分析的方法。
光电比色计利用滤光片获得入射光。 借助光电池和检流计测得吸光度。
3 分光光度法
可见光分光光度法的测定方法和原理与光电比 色法相同，但获得单色光的方法不同。
光电比色法：滤光片 分光光度法：棱镜、光栅 分光光度法采用的仪器是分光光度计。
解
影响测定结果准确度的因素 1 仪器的测量误差及其减免方法
透光率T与待测 物浓度c是负对 数关系
透光率读数误差 ΔT相同，但所 造成的浓度误差 却不一样。
测量的相对误差与透光率、吸光度的关系
误差最小时 T=36.8%, A=0.434
误差≤5% A为0.2~0.8
2 对比尔定律的偏离引起的误差 溶液浓度较高时，会出现标准曲线不成直线的现
校正方法：采用光学性质完全相同、厚度相同 的比色皿贮放参比溶液，调节仪器使透过参比皿的 吸光度为零。
参比溶液的选择方法：
（1）如果仅所测物质有吸收，其它试剂均无吸收， 则可用纯溶剂做参比溶液；
（2）如果显色剂或其它试剂略有吸收，应用空白 溶液（不加试样溶液）做参比溶液；
（3）如果试样中其它组分有吸收，但不与显色剂 反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液做参比溶 液；当显色剂略有吸收时，或干扰离子也与显色剂反 应时，可在试液中加入掩蔽剂后再加显色剂，以此溶 液作为参比。
8.2 朗伯-比尔定律
一束平行单色光通过有色溶液
界面 反射 损失 Ir
I0
入射光
被溶液 吸收的 光的强 度为Ia
It 透射光
bcm
朗伯-比尔定律
ε为摩尔吸光系数，单位为L/mol·cm ；
b为液层厚度，单位用cm表示； c为有色溶液的浓度，单位用mol/L表示。
ε为摩尔吸光系数，显色反应的灵敏度，ε越大表示 该显色物质对此波长的光吸收能力越强，显色反应 越灵敏。
ε的物理意义：吸光物质浓度为1mol/L，比色皿厚度 为1cm，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度。
测定方法 1 比较法（单点）
标准溶液 cs As As=εbcs 待测溶液 cx Ax Ax=εbcx
比较 得
2 工作曲线法 配制一系列已知准确浓度的标准溶液： c1 c2 c3 c4 ……cn 测得吸光度值： A1 A2 A3 A4 …… An 以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作工作曲线。
分光光度计的主要组成部件
光源
单色器
吸收池
检测系统
（1）光源 要求：发出所需波长范围内的连续光谱，由足
够强度且在一定时间内保持稳定。 常用：钨丝灯、钨卤素灯
（2）单色器 将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置，
称为单色器。 单色器由棱镜或光栅灯色散元件及狭缝和透镜
组成。
（3）吸收池 也叫比色皿, 用于盛装参比溶液和待测溶液，能
象，称为偏离比耳定律。
偏离原因： （1）非单色光
引起的偏离； （2）化学因素
引起的偏离。
8.4 显色反应及其影响因素
(1) 显色反应及其选择
将待测组分转变成有色化合物的反应叫做显色反应。 与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。 选择显色剂应考虑的因素： ① 灵敏度高：一般希望 ε 达到104 ~ 105 ② 选择性好：其它离子干扰少 ③ 显色剂在测定波长处无明显吸收 ④ 反应生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定。
c(µg/25ml)
测得未知试样的吸光度Ax，在标准曲线上找出其 对应的浓度cx。
6.3
c(µg/25ml)
曲线拟合 根据最小二乘法，利用一系列的标准 溶液的浓度及吸光度值计算出工作曲线的斜率和截距， 计算出未知样的浓度。
8.5 吸光光度分析的方法和仪器
吸光光度分析的方法
1 目视比色法 2 光电比色法
（4）检测系统 检测器 将透射光信号转化为电信号进行测量的
装置。光电管（灵敏度高、不易疲劳）。 指示器 把放大的信号以适当的方式显示或记录
下来。和检测器一起组成检测系统。
8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度
灵敏度的表示-摩尔吸光系数ε
例 0.0880mg Fe3+在酸性溶液中，以硫氰酸钾显色 后，用水稀释到50.00ml，在480nm处用1cm比色皿 测得吸光度A为0.220，计算该显色反应的摩尔吸光 系数。
一般情况下选择被测溶液的最大吸收波长为入 射光波长。这样测定的灵敏度和准确度都较高。
如果干扰物质在最大吸收波长处有强烈的吸收， 则可选其它波长，但要注意尽可能选择值随波长改 变而变化不太大的范围内的波长。
最大吸收波长处有干扰时，可选择其它一 处合适的波长来测定。
参比溶液的选择
在吸光度测量中，将发生反射、吸收和透射等 作用，由于反射以及溶剂、试剂等对光的吸收会造 成透射光的减弱，为使光强度减弱仅与溶液中待测 物质的浓度有关，必须进行校正。
第八章 吸光光Biblioteka 法吸光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收而建 立的一种分析方法。 可见分光光度法——Visible Spectrophotometry
特点：灵敏度高，微量、痕 量组分（10-4-10-5%）；准确 度高，2%-5%。
知识点：
1 单色光 复合光 互补光 2 吸收曲线、标准曲线 3 吸光度、透光率及其关系 4 朗伯-比尔定律的应用（计算） 5 分光光度计的基本组成部件 6 吸光光度法的灵敏度-摩尔吸光系数及其计算 7 影响测定结果准确度的因素（了解） 8 显色反应和测定条件的选择（了解）
8.1 物质对光的选择性吸收
物质之所以呈现五彩缤纷的不同颜色，就是因为 选择性地吸收了某些特定波长的可见光所致。例 如：高锰酸钾为紫色；重铬酸钾为橙色。
有色溶液颜色的深浅，与有色物质的浓度成正比。
高锰酸钾溶液吸收曲线
高锰酸钾溶液浓度不 同，最大吸收波长不变， 都是525nm。 在最大吸收波长处测定 吸光度，灵敏度最高。
显色反应条件的选择
显色剂用量 反应体系的酸度 显色反应的温度 显色反应的时间 干扰的消除
①加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂 ②控制溶液酸度 ③选择适当的波长 ④选择适当的参比溶液。
（2）吸光度测量条件的选择 入射光波长的选择 入射光的波长根据吸收光谱选择，选择的原则
是吸收最大，干扰最小。
吸光度读数范围的选择
当 T = 0.368（A=0.434）时，浓度测定的相对误差 最小。
光电比色法是利用光电比色计测定溶液的吸光度 以进行定量分析的方法。
光电比色计利用滤光片获得入射光。 借助光电池和检流计测得吸光度。
3 分光光度法
可见光分光光度法的测定方法和原理与光电比 色法相同，但获得单色光的方法不同。
光电比色法：滤光片 分光光度法：棱镜、光栅 分光光度法采用的仪器是分光光度计。
解
影响测定结果准确度的因素 1 仪器的测量误差及其减免方法
透光率T与待测 物浓度c是负对 数关系
透光率读数误差 ΔT相同，但所 造成的浓度误差 却不一样。
测量的相对误差与透光率、吸光度的关系
误差最小时 T=36.8%, A=0.434
误差≤5% A为0.2~0.8
2 对比尔定律的偏离引起的误差 溶液浓度较高时，会出现标准曲线不成直线的现
校正方法：采用光学性质完全相同、厚度相同 的比色皿贮放参比溶液，调节仪器使透过参比皿的 吸光度为零。
参比溶液的选择方法：
（1）如果仅所测物质有吸收，其它试剂均无吸收， 则可用纯溶剂做参比溶液；
（2）如果显色剂或其它试剂略有吸收，应用空白 溶液（不加试样溶液）做参比溶液；
（3）如果试样中其它组分有吸收，但不与显色剂 反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液做参比溶 液；当显色剂略有吸收时，或干扰离子也与显色剂反 应时，可在试液中加入掩蔽剂后再加显色剂，以此溶 液作为参比。
8.2 朗伯-比尔定律
一束平行单色光通过有色溶液
界面 反射 损失 Ir
I0
入射光
被溶液 吸收的 光的强 度为Ia
It 透射光
bcm
朗伯-比尔定律
ε为摩尔吸光系数，单位为L/mol·cm ；
b为液层厚度，单位用cm表示； c为有色溶液的浓度，单位用mol/L表示。
ε为摩尔吸光系数，显色反应的灵敏度，ε越大表示 该显色物质对此波长的光吸收能力越强，显色反应 越灵敏。
ε的物理意义：吸光物质浓度为1mol/L，比色皿厚度 为1cm，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度。
测定方法 1 比较法（单点）
标准溶液 cs As As=εbcs 待测溶液 cx Ax Ax=εbcx
比较 得
2 工作曲线法 配制一系列已知准确浓度的标准溶液： c1 c2 c3 c4 ……cn 测得吸光度值： A1 A2 A3 A4 …… An 以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作工作曲线。
分光光度计的主要组成部件
光源
单色器
吸收池
检测系统
（1）光源 要求：发出所需波长范围内的连续光谱，由足
够强度且在一定时间内保持稳定。 常用：钨丝灯、钨卤素灯
（2）单色器 将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置，
称为单色器。 单色器由棱镜或光栅灯色散元件及狭缝和透镜
组成。
（3）吸收池 也叫比色皿, 用于盛装参比溶液和待测溶液，能
象，称为偏离比耳定律。
偏离原因： （1）非单色光
引起的偏离； （2）化学因素
引起的偏离。
8.4 显色反应及其影响因素
(1) 显色反应及其选择
将待测组分转变成有色化合物的反应叫做显色反应。 与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。 选择显色剂应考虑的因素： ① 灵敏度高：一般希望 ε 达到104 ~ 105 ② 选择性好：其它离子干扰少 ③ 显色剂在测定波长处无明显吸收 ④ 反应生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定。
c(µg/25ml)
测得未知试样的吸光度Ax，在标准曲线上找出其 对应的浓度cx。
6.3
c(µg/25ml)
曲线拟合 根据最小二乘法，利用一系列的标准 溶液的浓度及吸光度值计算出工作曲线的斜率和截距， 计算出未知样的浓度。
8.5 吸光光度分析的方法和仪器
吸光光度分析的方法
1 目视比色法 2 光电比色法