蛋白质工程及其应用示例

蛋白质工程及其应用示例

摘要：在论述蛋白质工程的基本概念和由来的基础之上, 介绍了蛋白质工程的主要内容，并着重阐述了蛋白质工程在工业用酶、食品行业和生物制药三个方面中的应用和前景。

关键词：蛋白质工程；简介；发展与应用；

1.蛋白质工程的概念和由来

蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础的学科，其主要通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。

蛋白质工程最早始于1975年美国C. A. Hutehison使用了J. Lederberg 1960年推荐的寡脱氧核糖核普酸作为体外诱变剂，经他重新确定此诱变剂的顺序，成功地实现了定位突变试验，培育出了具有各类生物学特性的突变株[1]。而蛋白质工程的命名是1981年由美国的K.Ulemer确定的[2]。继后，许多大学及著名的实验室以及经营生物工程高技术产业的公司大量投资竞相研究与开发。

2.蛋白质工程的基本途径

从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸（基因）

3.蛋白质工程的基本原理

基因工程通过分离目的基因重组DNA分子，使目的基因更换宿主得以异体表达，从而创造生物新类型，但这只能合成自然界固有的蛋白质。蛋白质工程则是运用基因工程的DNA重组技术，将克隆后的基因编码序列加以改造，或者人工合成新的基因，再将上述基因通过载体引入适宜的宿主系统内加以表达，从而产生数量几乎不受限制、有特定性能的“突变型”蛋白质分子，甚至全新的蛋白质分子。

4.蛋白质工程的研究内容

4.1 蛋白质结构分析 --- 基础

蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。三维空间结构的测定是验证蛋白质设计的假设即证明是新结构改变了原有的生物功能的必需手段。晶体学的技术在确定蛋白质结构方面有了很大发展，但是最明显的不足是需要分离出足够量的纯蛋白质(几毫克~几十毫克)，制备出单晶体，然后再进行繁杂的数据收集、计算和分析。对子哪些很微量的蛋白质来说，是比较困难的。另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的。肤链结构，这种方法绕过了结晶、X一射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。

现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。国外有许多研究机构正在致力与研究蛋白质与核酸、酶抑制剂与蛋白质的结合情况，以开发具有高度专一性的药用蛋白质。

4.2 蛋白质结构、功能的设计和预测 --- 基础的应用与验证

根据对天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里的数据，可以预测一定氨基酸序列肤链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在的两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。目前，正加紧这方面的工作。虽然尚在起步阶段，但在可预见的将来，建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。

4.3 蛋白质的创造和改造 --- 最终目标

蛋白质的改造，从简单的物理、化学法到复杂的基因重组等等有多种方法。物理、化学法: 对蛋白质进行变性、复性处理，修饰蛋白质链官能团，分割肤链，改变表面电荷分布促进蛋白质形成一定的立体构像等等；生物化学法: 使用蛋白酶选择性地分割蛋白质，利用转糖昔酶、酚酶、酸酶等去除或连接不同化学基团，

利用转酞胺酶使蛋白质发生胶连等等。以上方法只能对相同或相似的基团或化学键发生作用. 缺乏特异性，不能针对特定的部位起作用。采用基因重组技术或人工合成D N A，不但可以改造蛋白质而且可以实现从头合成全新的蛋白质。蛋白质是由不同氨基酸按一定顺序通过肚键连接而成的肤构成的。氨基酸序列就是蛋白质的一级结构，它决定着蛋白质的空间结构和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白质的基因的DNA序列决定的，改变DNA序列就可以改变蛋白质的氨基酸序列，实现蛋白质的可调控生物合成。在确定基因序列或氨基酸序列与蛋白质功能之间关系之前，宜采用随机诱变，造成碱基对的缺失、插入或替代，这样就可以将研究目标限定在一定的区域内，从而大大减少基因分析的长度。一旦目标D N A 明确以后，就可以运用定位突变等技术来进行研究。

4.3.1 定位突变

蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸，研究蛋白质结构、稳定性和催化特性。噬菌体M13的生活周期有二个阶段，在噬菌体粒子中其基因组为单链，侵入宿主细胞以后，通过复制以双链形式存在。将待研究的基因插入载体M 13，制得单链模板，人工合成一段寡核昔酸(其中含一个或几个非配对碱基)作为引物，合成相应的互补链，用连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子的胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。

4.3.2 盒式突变

1 98 5 年wels提出的一种基因修饰技术—盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链D N

A 片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因[3]。

4.3.3 PCR技术

DNA聚合酶链式反应是应用最广泛的基因扩增技术。以研究基因为模板，用人工合成的寡核昔酸(含有一个或几个非互补的碱基)为引物，直接进行基因扩