大肠杆菌发酵经验总结
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结
首先,补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量(主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量,进而影响),所以适当的控制补料速率和比生长速率,对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次,必须要保证充足的溶氧,并严格控制pH值,而且补酸碱的速率尽量缓和,不能太快;温度对于蛋白的表达也有很重要的影响,较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的,而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三,选取合理的诱导时间非常重要,一般的诱导时间选在指数生长后期,而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之,选在此时诱导,1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开,使这两个阶段互不影响,有利于蛋白的高表达;2.已经得到了大量的菌体,而且菌体的生物量基本接近稳定,不论是从动力学角度,还是能耗,物料成本方面,都比较合理。
第四,补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高,会使菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代产物的积累,氮源不足,则菌体繁殖量少从而影响产量;碳源过多,则容易刑场较低的pH,抑制菌体生长,碳源不足,则容易引起菌体的衰老和自溶。另外,碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质,从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验,一般情况下,对于一个稳定的发酵工艺下,如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象,而且能排除噬菌体和染菌的可能性后,那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响,现总结以下几点,并作出相应解决措施。
一、代副产物-乙酸
乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代副产物,在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一,一般认为在好气性条件下,5~10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时,细胞将会停止生长,当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
预防乙酸产生的措施:
1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生:
比生长速率越高,乙酸产生越多,当比生长速率超过某个值时,乙酸开始产生。可以通过降低温度,调节酸碱度,控制补料等方法来降低比生长速率。
2、透析培养:
在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质,降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。
3、控制葡萄糖的浓度:
葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一,用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上,以减少乙酸的产生。
常用的控制方法主要有:
恒pH法:大肠杆菌会代葡萄等产生乙酸,使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标,该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代的结果,容易造成补料体系出错。
恒溶氧法:菌体代时会消耗氧,使溶氧下降,当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代下降,消耗氧能力下降,溶氧上升。因此,根据溶氧曲线补加葡萄糖,保持溶氧恒定,可以控制葡萄糖在一定的水平。
二、温度
大肠杆菌发酵最适温度是37 C,当温度最适菌体生长时,比增长速率将会增大。随温度上升细菌代加快,其产生代副产物也会增加。这些副产物会对菌体的生长产生一定的抑制作用。菌体生长过快也会影响质粒的稳定性。降低培养温度,菌体对营养物质的摄取和生长速率都会下降。同时也减少了有毒代副产物的产生和代热的产生。有时降低温度更有利于目的蛋白的正确折叠及表达。在重组大肠杆菌的发酵中不同发酵阶段其最适温度也不同,为了能获得大量的目的蛋白,首先要保证菌体的量,因此在前期可优先考虑菌体的生长,到诱导阶段应将目的产物的表达放在首位。
三、培养方式
微生物的培养方式主要有分批、连续和补料分批3种。大肠杆菌发酵大多采用补料分批培养,这是在现代发酵工艺得到优化的一种方式,能有效的优化微生物培养过程中的化学环境。使微生物处于最佳的生长环境。这种方式一方面可以避免某些营养成分初始浓度过高出现底物抑制现象,另一方面能够防止限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。补料
分批培养已广泛应用于各种各样的初级、次级生物产品和蛋白等的发酵生产中。
生物技术研究者追求的两个主要目标,一是新型生物产品的开发,另一就是为传统的或新生生物产品,寻求更经济的生产方式。近十年来,利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物,是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里,如何创造更经济、更有效的方法,来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力,已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。
利用重组DNA技术生产重要的生物药物,在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存,重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择;(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞积累、胞聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定;(3)重组基因最大表达的分子策略;(4)细胞生长和生产环境的优化;(5)发酵条件的优化;(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标,整个生产过程的最优化才能实现。
(一)细胞生长环境的优化策略
要提高细胞密度和生产率,首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化,包括生长培养基的组成,培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下,避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。
1.培养基组成的优化
培养基常含有碳(能)源、氮源,以及微营养物如维生素和微量元素,这些营养物的浓度与比例,对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如,过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸;链霉菌在60~80 mmol/L -淀粉酶的产量可提高2倍。的产率显著提高。此外还发现,限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长,但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况,其重组CO32-存在下,其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多;在重组微生物达到高细胞密度后,限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素
培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地,当流加培养基中含有酵母膏时,重组蛋白不稳定;而当流加培养基中含有蛋白胨时,大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中,不但所生产的重组蛋白非常稳定,