CHO细胞高效表达载体的优化

哺乳动物细胞作为重组蛋白表达的常用宿主 ,与大肠杆 菌 、酵母及昆虫细胞相比 ,具有更加精确的转录后加工和翻 译后修饰 ,其表达产物在分子结构 、理化性质和生物学功能 等方面与天然蛋白更为接近 [1 ] ,可以进行大规模 、高密度的 培养 [2 ] 。其中 CHO细胞是目前重组糖基化蛋白生产的首选 宿主 [3 ] ,但是该细胞系在表达外源基因时存在着培养成本 高 、周期长 、表达量低等问题 。因此建立 CHO 细胞高效表达 体系 ,实现外源基因的高效表达是重组蛋白药物研究和生产 的关键所在 。本研究着力于构建新型高效表达载体 ,通过优 化目的基因表达单元 ,实现了表达载体在 CHO 细胞中的高 表达 。
中国仓鼠 EF12α是一个能在大部分组织细胞中高效表
达的基因 ,其转录调控序列包括启动子 、增强子及其他利于 转录的顺式作用元件等 ,位于该基因的侧翼序列内 ;我们尝 试将 EF12α基因的转录调控序列应用于以往构建的表达载 体中 ,转染 CHO细胞并检测蛋白的表达量 ,进一步筛选能够
[收稿日期 ] 2005 - 12 - 31 [基金项目 ] 国家高技术研究发展计划 (“863”计划 )资助项目
及启动子 + 3′UTR 1. 65 kb、CHEF12α5′UTR及启动子 + 3′UTR 2. 7 kb这 2种组合均可有效提高目的基因 tPA 的表
达 ,表达效率与对照载体相比分别提高了 65. 9%和 54. 5%。在添加翻译增强子 V163 后 ,载体 pMCEdEF53 Ⅲ2
163frt2k2 tPA 的表达效率为对照载体的 2. 65倍 。结论 :该载体系统在重组蛋白药物的研发方面具有良好的应用前
5 ′2A cacagcgttgtgca tagaaacaga tgcaggcaaaac23 ′ 5 ′2CTGA TA TCGGA TTTGAA TTA GCGGTGGTTTTCACAACACC23 ′ 5′2Tatctagatattacccctaacacctgccaccccagtc23′ 5 ′2TA TCTCGA GGACTTGGTTTCAA TTCCCA GCACCTAAA TGG23 ′ 5′2A tatgatcatattacccctaacacctgcc23′ 5 ′2GA TCTCGA GCAA TGCACAA GA TGAACCC 23 ′ 5 ′2GA TCTCGA GTACA GGCCA TTA GGTCCC23 ′ 5 ′2GA TCTCGA GCAA GA GCCA GGTTGTGG23 ′ 5′2CGATAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGCTGCGACAGTCCACTA 23′ 5′2AACGGAACACTGGATCCGCGAGA 23′ 5 ′2ACGA TA TCCA GGTAA GTgccgccaccA TGA TTGAACAA GA TGGA TTGCACG23 ′ 5 ′2GGGCA TGGA TTTCCTGGCT23 ′ 5 ′2A GCGCA GA GGCTTGGGGCA G23 ′ 5 ′2GGTTTCGGA GGCCGTCCGGGG23 ′
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军事医学科学院院刊 2006年 8月 第 30卷 第 4期
和 CHO匹配的高效表达载体 。实验中我们选取了中国仓鼠 EF12α基因的 5′端和 3′端非翻译区调控序列 ,并以此为基础 构建了一系列表达载体 ,以 tPA 为报告基因 ,利用 CBiblioteka BaiduO 2dh2 fr- 2Z+定点整合系统 [4 ]对其表达效率进行比较 ,最后筛选到 一个新型高效表达载体 ,其表达效率是原有载体的 2165倍 。
物学技术 ,构建了一系列基于 CHEF12α基因的非翻译区调控序列元件的新型真核表达载体 。以组织型纤溶酶原
激活剂突变体 ( k2 tPA )作为报告基因 ,利用本室已建立的 CHO 2dhfr- 2Z+定点整合表达系统比较载体表达外源基因 的能力 ,挑选表达量高的载体 。进一步添加翻译增强子 ( H213及 V163)序列 ,再进行评价 。结果 : CHEF12α5′UTR
1. 2 PCR引物 实验所用 PCR引物序列见表 1。
片段名称
表 1 表达载体构建所用 PCR引物序列 序 列
PCHEF51 PCHEF52 PCHEF31 PCHEF32 PCHEF121 PCHEF122 PCHEF123 PCHEF124 pHSP1 pHSP2 Pneo7 S30 V1 V4
1 材料和方法
1. 1 材料与试剂 菌株 DH5α为本室保存 ,用于定点整合的 CHO 2dhfr- 2
Z+ (二氢叶酸还原酶基因缺陷的中国仓鼠卵巢细胞 )细胞系 由本室构建 ,它是将融合基因 Lac2ZeocinTM 和 FRT ( Flp 2re2 combination target)位点整合到 CHO 2dhfr- 细胞株基因组的转 录活跃区 ,用含 50 μg/m l zeocin 的完全培养基维持 ; 质粒 pMCEdfrt2k2 tPA (图 1)为本室构建的用于定点整合的新型高 效哺乳动物细胞表达载体 ; 质粒 pOG44 由本所陈昭烈研究 员惠赠 ,含表达 Flp重组酶的基因 。
( 2001AA 215351 ) [作者简介 ] 刘 珊 ( 1980 - ) , 女 , 北京市人 , 在读硕士生 ,
Tel: 010266948829; E2mail: iceicequeen @ yahoo. com. cn。 3 通讯联系人 , Tel: 010266948828; E2mail: yuwy@ nic. bm i. ac. cn。
军Bu事ll医Ac学ad科M学il院Me院d 刊Sci , A20u0g62年0068;月 第 V3o0l卷30第 N4o期4
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CHO 细胞高效表达载体的优化
论 著
刘 珊 , 刘志刚 , 张国强 , 俞炜源 3
(军事医学科学院生物工程研究所 ,北京 100071)
[摘要 ] 目的 :研究分析中国仓鼠 EF12α基因的转录调控序列 ,以构建新型高效表达载体 。方法 :利用常规分子生
景。
[关键词 ] CHEF12α基因 ; CHO / dhfr- 细胞 ;基因表达 ;组织型纤溶酶原激活物
[中图分类号 ] Q786
[文献标识码 ] A
[文章编号 ] 100025501 (2006) 0420301205
Con struction and eva lua tion of h igh expression vectors in mamma lian cells w ith Ch i2 nese ham ster EF12α gene
1. 3 方法 1. 3. 1 常规分子生物学方法 参照文献 [ 5 ]进行 。 1. 3. 2 细 胞 培 养 CHO 2dhfr- 2Z+ 细 胞 常 规 培 养 采 用 含 4 mmol/L L 2谷氨酰胺的 IMDM 培养基 ,并添加 1. 5 g/L 的 NaHCO3 , 0. 1 mmol/L 次 黄 嘌 呤 , 0. 016 mmol/L 胸 苷 以 及 10%小牛血清 ,添加抗生素 zeocin,浓度为 100 μg/m l。当筛 选定点重组 tPA 的细胞株时 ,将抗生素改为 G418,浓度为 400μg/m l。 1. 3. 3 CHO 细胞基因组的提取 按照 Promega公司的试 剂盒进行 。 1. 3. 4 含有中国仓鼠 EF12α基因 5′和 3′端调控序列的载体
enhancer H213 and V163 were selected to app raise the exp ression efficiency. Results: The recombinant exp ression vectors w ith two regulatory elements combination (CHEF12α5′UTR + 3′UTR 1. 65 kb, CHEF12α5′UTR + 3′UTR 2. 7 kb) in2 creased the exp ression efficiency by 65. 9% and 54. 5% respectively. W hen the translational enhancer V163 was added, the highest exp ression efficiency of the vector could reach 2. 65 times that of the control vector. Conclusion : The CHEF12 α vectors w ill be p rom ising in the high2level p rotein exp ression study. [ Key words] CHEF12α gene; CHO / dhfr- cell; gene exp ression; tissue p lasm inogen activation
L IU S han, L IU Z h i2Gang, ZHAN G Guo2Q iang, YU W ei2Yuan3
( Institute of B iotechnology, Academy of M ilitary M edical Sciences, Beijing 100071, China)
常用限制性内切酶 、T4 DNA 聚合酶 、T4 DNA 连接酶 、 pfu DNA 聚合酶 、T4 PNK、dNTP等购自 TaKaRa公司和 NEB 公司 。血 清 和 IMDM 培 养 基 购 自 Hyclone 公 司 。抗 生 素 G418购自 Sigma公司 。纤维蛋白原 、凝血酶购自中国药品 生物制品检定所 。其他常用生化试剂购自军事医学科学院 条件处 ,为分析纯 。
[ Abstract] O bjective: To construct new mammalian exp ression vectors and evaluate the exp ression level of foreign gene w ith the transcrip tion regulatory sequences from Chinese ham ster EF12α gene. M ethods: A series of exp ression vectors w ith the transcrip tion regulatory sequences from Chinese ham ster EF12α gene were constructed by using standard p rocedure. The exp ression efficiency of these vectors was evaluated by using the targeted integration system , based on the assay of k2 tPA ( a mutant of tPA ) activity by monitoring fibrin clearance. Furthermore, two vectors which included the translational
图 1 pM CEdfrt2k2 tPA载体的结构示意图 hCMV 启动子. 人巨细胞病毒的极早期启动子 ; K2 tPA. 组织型纤溶酶 原激活剂的突变体 ; IRES. 核糖体内部进入位点 ; dhfr. 二氢叶酸还原 酶基因 ; BGH PolyA. 牛生长因子的多聚腺苷酸 ; Neo. 氨基糖苷转移 酶基因