β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究
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β-Lg具有很强的脂肪酸结合力，一般作为功能性配料使用。由于β-乳球蛋白对 脂溶性维生素（如VA，VE等）有一定的吸附作用，可作为维生素的载体应用在食 品加工中。目前，一些生产商已采用热诱导β-乳球蛋白胶来模仿和替代脱脂食品中 的动物脂肪[5]，从而作为脂肪的替代品应用在低脂食品的加工生产中。此外，β-Lg 固有的生物活性，如抗氧化性，可以应用于化妆品生产。
课题 安徽省自然科学基
来源
金
学生姓名
李晋津
专业 食品质量与安全 学号
08118027
指导教师姓名
薛秀恒
职称
讲师
研
实验拟以β-乳球蛋白改性及降低β-乳球蛋白含量为目标，通过中性蛋白酶水解β-
究 乳球蛋白的水解条件的单因素实验及正交实验，确定出水解β-乳球蛋白的最佳酶解条
内
容 件，并对其酶解产物进行电泳检测，检验酶解程度。
安徽农业大学
毕 业 论 文（设计）
论文题目
β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究
姓名
李晋津
学 号 08118027
院 系 茶与食品科技学院 专 业 食品质量与安全
指导教师六月
安徽农业大学学士学位论文（设计）开题报告
课题名称
中性蛋白酶水解β-乳球蛋白条件的研究
特
运用 SAS 系统统计正交实验结果得出最佳酶解条件，通过 SDS-PAGE 蛋白
色
与 电泳证明，β-乳球蛋白被酶解为小肽。
创
新
指 教
导 研
教 室
师 意
意 见
见
学 院 意 见
主要领导签名： 年月日
目录
摘要................................................................................................................................... 1 一、引言........................................................................................................................... 1
2.2.1 试剂........................................................................................................... 4 2.2.2 主要仪器设备........................................................................................... 4 2.3 实验方法............................................................................................................. 4 2.3.1 测定指标与方法....................................................................................... 4 2.4 试验方案的设计................................................................................................. 6 2.4.1 温度对β-乳球蛋白水解影响的检测方法................................................6 2.4.2 时间对β-乳球蛋白水解影响的检测方法................................................6 2.4.3 酶添加量对β-乳球蛋白水解影响的检测方法........................................6 2.4.4 正交实验................................................................................................... 7 2.4.5 电泳实验................................................................................................... 7 三、 结果与分析............................................................................................................. 9 3.1 温度对氨基酸态氮含量的影响结果................................................................. 9 3.2 时间对氨基酸态氮含量的影响结果................................................................. 9 3.3 酶添加量对氨基酸态氮含量的影响结果....................................................... 10 3.4 正交实验结果................................................................................................... 11 3.5 电泳检测结果................................................................................................... 13 四、讨论......................................................................................................................... 14 五、结论......................................................................................................................... 15 致谢................................................................................................................................. 17 参考文献......................................................................................................................... 18 Abstract.......................................................................................................................... 20
第一阶段（2011/11/02—2011/12/02）查相关资料； 研 究 第二阶段（2011/12/02—2012/01/20）准备试验材料做预备试验；
计 第三阶段（2012/01/30—2012/03/07）做单因素和正交试验并取得相关数据； 划
第四阶段（2012/04/10—2012/06/06） 整理分析数据并写论文。
关键词：中性蛋白酶；β-乳球蛋白；酶解；小肽
一、引言
1.1 β-乳球蛋白的结构与应用
β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是由乳腺上皮细胞合成的特有蛋白，普遍 存在于驯鹿、猪、马、羊、猫和狗等多种哺乳动物的乳汁中，但是在单峰驼和人 乳中不存在或含量甚微[1]。
牛奶中的β-Lg 分子质量在 18 kD 左右，等电点为 5.3，共由 162 个氨基酸残基 组成，含有 5 个半胱氨酸残基。β-Lg 由非共价键连接的 2 个单位亚基组成，每个 单体含有 2 个二硫键（Cys66-Cys160 和 Cys106-Cysl19）和一个自由巯基（Cysl21）。 β-Lg 在牛奶中主要以二聚体的形式存在，二聚体像一个拉长的椭圆体，长约 6.95nm，宽约 3.6nm[2]。β-Lg 具有紧密的三级结构，单体近似球形，它的三维结构 在 pH 中性时，由 8 条反平行链组成β-桶状结构，有 1 个α+1 拓扑，此结构外部有 1 个含有 3 个转角的 a-螺旋和 9 条β链（A、B、C、D、E、F、G、H、I）[1]。A-D 链形成一个面，E-H 链形成另外一个面。A 链与其它 3 条链（B、H、I）氢键结合， A 链和 H 链之间的结合形成β-桶状结构的闭合，外面有 a-螺旋保护β-桶状结构[3]。 EF 链形成的结构作为结合位点的“大门”，当 pH 较低时，“大门”关闭，结合位 点受抑制；当 pH 较高时，“大门”开放，配体可以与结合位点结合。如图 1-1。
β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究
作者：李晋津
指导老师：薛秀恒
（安徽农业大学茶与食品科技学院
合肥 230036）
摘要：本实验以β-乳球蛋白为原料，通过单因素与正交实验，以甲醛滴定法测定
蛋白水解后氨基酸态氮含量，确定中性蛋白酶水解β-乳球蛋白的最佳温度、时间、 酶添加量，以实现β-乳球蛋白的改性及降解β-乳球蛋白。结果表明，中性蛋白酶水 解β-乳球蛋白的最佳条件为 50℃水浴温度下，0.0079g 中性蛋白酶水解 40 分钟； SDS-PAGE 蛋白电泳显示，β-乳球蛋白被酶解为小肽。
1.1 β-乳球蛋白的结构与应用...................................................................................1 1.2 β-乳球蛋白的致敏性及其水解改性...................................................................2 二、实验材料与方法....................................................................................................... 4 2.1 实验材料............................................................................................................. 4 2.2 试剂与仪器设备................................................................................................. 4
1
图 1-1 β-乳球蛋白的三维结构示意图
研究表明，β-乳球蛋白中心形成一个疏水性结构，β-乳球蛋白具有很强的结合 脂溶性维生素及脂肪酸的能力，可以作为像 VA、VE 等脂溶性营养物质的添加载体， 这可用于生产无脂或低脂且富含脂溶性维生素的营养食品。
目前，β-乳球蛋白的应用主要是在食品工业上，由于其具有多种生物学活性， 同时经蛋白酶水解后仍可得到多种生物活性肽，因此被应用于食品加工中。β-Lg 的热变性与牛奶加工密切相关，可以利用在不同加热条件下，β-Lg 含量的变化规 律区分不同加工类型的牛奶。国际乳业联合会（IDF）规定巴氏杀菌乳和高温巴氏 杀菌乳中可溶性β-Lg 的质量浓度应分别大于 2600mg/L 和 2000mg/L，UHT 乳中可 溶性β-Lg 浓度应高于 50mg/L[4]。因此，β-Lg 可以作为牛奶热加工程度的评价指标。 在生奶样中添加β-乳球蛋白，不仅可以增加乳清蛋白的浓度，而且还能推迟 UHT 乳（瞬时超高温灭菌乳）的凝集时间。
课题 安徽省自然科学基
来源
金
学生姓名
李晋津
专业 食品质量与安全 学号
08118027
指导教师姓名
薛秀恒
职称
讲师
研
实验拟以β-乳球蛋白改性及降低β-乳球蛋白含量为目标，通过中性蛋白酶水解β-
究 乳球蛋白的水解条件的单因素实验及正交实验，确定出水解β-乳球蛋白的最佳酶解条
内
容 件，并对其酶解产物进行电泳检测，检验酶解程度。
安徽农业大学
毕 业 论 文（设计）
论文题目
β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究
姓名
李晋津
学 号 08118027
院 系 茶与食品科技学院 专 业 食品质量与安全
指导教师六月
安徽农业大学学士学位论文（设计）开题报告
课题名称
中性蛋白酶水解β-乳球蛋白条件的研究
特
运用 SAS 系统统计正交实验结果得出最佳酶解条件，通过 SDS-PAGE 蛋白
色
与 电泳证明，β-乳球蛋白被酶解为小肽。
创
新
指 教
导 研
教 室
师 意
意 见
见
学 院 意 见
主要领导签名： 年月日
目录
摘要................................................................................................................................... 1 一、引言........................................................................................................................... 1
2.2.1 试剂........................................................................................................... 4 2.2.2 主要仪器设备........................................................................................... 4 2.3 实验方法............................................................................................................. 4 2.3.1 测定指标与方法....................................................................................... 4 2.4 试验方案的设计................................................................................................. 6 2.4.1 温度对β-乳球蛋白水解影响的检测方法................................................6 2.4.2 时间对β-乳球蛋白水解影响的检测方法................................................6 2.4.3 酶添加量对β-乳球蛋白水解影响的检测方法........................................6 2.4.4 正交实验................................................................................................... 7 2.4.5 电泳实验................................................................................................... 7 三、 结果与分析............................................................................................................. 9 3.1 温度对氨基酸态氮含量的影响结果................................................................. 9 3.2 时间对氨基酸态氮含量的影响结果................................................................. 9 3.3 酶添加量对氨基酸态氮含量的影响结果....................................................... 10 3.4 正交实验结果................................................................................................... 11 3.5 电泳检测结果................................................................................................... 13 四、讨论......................................................................................................................... 14 五、结论......................................................................................................................... 15 致谢................................................................................................................................. 17 参考文献......................................................................................................................... 18 Abstract.......................................................................................................................... 20
第一阶段（2011/11/02—2011/12/02）查相关资料； 研 究 第二阶段（2011/12/02—2012/01/20）准备试验材料做预备试验；
计 第三阶段（2012/01/30—2012/03/07）做单因素和正交试验并取得相关数据； 划
第四阶段（2012/04/10—2012/06/06） 整理分析数据并写论文。
关键词：中性蛋白酶；β-乳球蛋白；酶解；小肽
一、引言
1.1 β-乳球蛋白的结构与应用
β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）是由乳腺上皮细胞合成的特有蛋白，普遍 存在于驯鹿、猪、马、羊、猫和狗等多种哺乳动物的乳汁中，但是在单峰驼和人 乳中不存在或含量甚微[1]。
牛奶中的β-Lg 分子质量在 18 kD 左右，等电点为 5.3，共由 162 个氨基酸残基 组成，含有 5 个半胱氨酸残基。β-Lg 由非共价键连接的 2 个单位亚基组成，每个 单体含有 2 个二硫键（Cys66-Cys160 和 Cys106-Cysl19）和一个自由巯基（Cysl21）。 β-Lg 在牛奶中主要以二聚体的形式存在，二聚体像一个拉长的椭圆体，长约 6.95nm，宽约 3.6nm[2]。β-Lg 具有紧密的三级结构，单体近似球形，它的三维结构 在 pH 中性时，由 8 条反平行链组成β-桶状结构，有 1 个α+1 拓扑，此结构外部有 1 个含有 3 个转角的 a-螺旋和 9 条β链（A、B、C、D、E、F、G、H、I）[1]。A-D 链形成一个面，E-H 链形成另外一个面。A 链与其它 3 条链（B、H、I）氢键结合， A 链和 H 链之间的结合形成β-桶状结构的闭合，外面有 a-螺旋保护β-桶状结构[3]。 EF 链形成的结构作为结合位点的“大门”，当 pH 较低时，“大门”关闭，结合位 点受抑制；当 pH 较高时，“大门”开放，配体可以与结合位点结合。如图 1-1。
β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究
作者：李晋津
指导老师：薛秀恒
（安徽农业大学茶与食品科技学院
合肥 230036）
摘要：本实验以β-乳球蛋白为原料，通过单因素与正交实验，以甲醛滴定法测定
蛋白水解后氨基酸态氮含量，确定中性蛋白酶水解β-乳球蛋白的最佳温度、时间、 酶添加量，以实现β-乳球蛋白的改性及降解β-乳球蛋白。结果表明，中性蛋白酶水 解β-乳球蛋白的最佳条件为 50℃水浴温度下，0.0079g 中性蛋白酶水解 40 分钟； SDS-PAGE 蛋白电泳显示，β-乳球蛋白被酶解为小肽。
1.1 β-乳球蛋白的结构与应用...................................................................................1 1.2 β-乳球蛋白的致敏性及其水解改性...................................................................2 二、实验材料与方法....................................................................................................... 4 2.1 实验材料............................................................................................................. 4 2.2 试剂与仪器设备................................................................................................. 4
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图 1-1 β-乳球蛋白的三维结构示意图
研究表明，β-乳球蛋白中心形成一个疏水性结构，β-乳球蛋白具有很强的结合 脂溶性维生素及脂肪酸的能力，可以作为像 VA、VE 等脂溶性营养物质的添加载体， 这可用于生产无脂或低脂且富含脂溶性维生素的营养食品。
目前，β-乳球蛋白的应用主要是在食品工业上，由于其具有多种生物学活性， 同时经蛋白酶水解后仍可得到多种生物活性肽，因此被应用于食品加工中。β-Lg 的热变性与牛奶加工密切相关，可以利用在不同加热条件下，β-Lg 含量的变化规 律区分不同加工类型的牛奶。国际乳业联合会（IDF）规定巴氏杀菌乳和高温巴氏 杀菌乳中可溶性β-Lg 的质量浓度应分别大于 2600mg/L 和 2000mg/L，UHT 乳中可 溶性β-Lg 浓度应高于 50mg/L[4]。因此，β-Lg 可以作为牛奶热加工程度的评价指标。 在生奶样中添加β-乳球蛋白，不仅可以增加乳清蛋白的浓度，而且还能推迟 UHT 乳（瞬时超高温灭菌乳）的凝集时间。