腐植酸应用技术论坛【2】：腐植酸的提取和分离

腐植酸应用技术论坛[2]：腐植酸的提取和分离
作者：成绍鑫 2008-05-27 19:13:40
所谓腐植酸的提取（萃取）、分离和分级，不是指得到纯化合物，而只是企图把它们从原料中和无机矿物质及非腐植酸的有机成分分离开来。

但由于腐植酸是具有很强络合、吸附性能的胶体物质，要去尽其中的金属离子、硅酸盐等矿物质是不容易的。

因此，分离、分级和纯化，仍然是企图得到无机质很少、组分相对均一、分子结构相对接近的一族组分，而不是单独化合物。

本节主要从实用角度介绍这方面的处理技术。

2.1 萃取剂
为有效提取出腐植酸，首要条件是充分切断腐植酸与各种金属的结合键，破坏与非腐植物质的极性、非极性吸附力、氢键缔合力等的作用，萃取剂的选择是关键因素。

选择萃取剂的原则包括：1）应具有高极性和高介电常数，以利于荷电分子的分散；2）分子尺寸小，以利于渗入腐植酸结构中；3）能破坏已存在的氢键而代之以HA-溶剂间的氢键；4）能固定金属阳离子。

符合上述条件的的萃取剂种类很多，包括强碱液、中性盐、有机酸盐、有机溶剂和有机螯合物5类。

但S tevenson特别强调，萃取过程一要完全，二要普遍适用，三要不改变腐植酸组成性质。

所以，较适用的提取剂是强碱或某些无机盐（ NaOH、 KOH、 Na2CO3、Na4P2O7）、有机碱，包括EDTA（乙二胺四乙酸钠盐）、EDA（乙二胺）、 DMF（二甲基甲酰胺）、 DMSO（二甲基亚砜）等。

一般来说，NaOH和KOH的萃取率最高，其萃取过程属离子交换反应，简化反应式为：
HA（COOH）n + nNaOH→HA（COONa）n + nH2O
高钙镁腐植酸一般用焦磷酸钠（Na4P2O7）萃取，这是因为Na4P2O7能把与HA结合的等离子置换出来，形成可溶性的HA钠盐和不溶性的焦磷酸盐（复分解反应），反应式为：
HA[COOMe(OH)2]m(COOCa1/2)n-m+[(n-m)/4]Na4P2O7→HA[COOMe(OH)2]m(COONa)n-m
+[(n-m)/4]Ca2P2O7↓
Na2S和Na2CO3也可萃取高钙镁腐植酸。

事先用稀盐酸浸泡此类原料，用水洗涤，脱除高价金属离子后再用碱液提取腐植酸，萃取率更高些，但存在HCl的污染处理问题。

大多数中性盐和有机溶剂作萃取剂，主要用于研究，生产上实用意义不大。

含氮有机试剂作提取剂，还可能被腐植酸不可逆吸附、改变其分子组成结构。

2.2 提取和分离技术
作为一般应用腐植酸的生产,
，可以不过分考虑腐植酸组成结构的变化，可在苛刻条件下萃取腐植酸。

但用于实验研究所用样品的制取，就必须慎重。

腐植酸与非腐植物质的夹带、SiO2胶体的溶出、自动氧化、结构分解、氨基-
羰基缩合等化学变化，都可能影响腐植酸的组成，以致同一个腐植酸样品在不同条件下萃取的元素组成、分子量、官能团、结构参数大相径庭。

因此，萃取条件既要温和，尽可能使原始HA组成性质不发生太大变化，其操作条件的掌握是至关重要的。

大致要点是：
1、游离腐植酸提取。

一般用0.1~0.5mol/L的NaOH, 固/液比1:3~1:5, 室温下通氮气操作,
尽量避免与氧接触；
2、高钙镁腐植酸的提取。

一般用0.1mol/L的Na4P2O7溶液(pH≈7)；对极难分离的土壤HA，也可用0. 1mol/LNa4P2O7+0.1mol/LNaOH(pH13)提取；
3、有的高钙镁低级别煤中的黄腐酸可用阳离子交换树脂、无机酸、丙酮-水-HCl(H2SO4)混合液提取；
4、与Fe3+、Al3+等高价离子或其水合氧化物络合的腐植酸复合物，只有用强螯合剂（EDTA-
Na等）、DMSO+1%HCl、10%乙酰丙酮+无水蚁酸等分离和提取HA；
5、如果想要从土壤和其它物质中直接提取腐植酸的金属-有机络合物，可选用Na型Dowex A-
1（亚氨二乙酸型）树脂。

6、泥炭、有机土壤，甚至某些褐煤中含有一定数量的类脂物质和沥青质（主要为高级脂肪酸的酯类），会干扰腐植酸的萃取，应事先用苯、甲苯或苯-乙醇混合液处理予以脱除。

7、泥炭事先用5%HCl处理易水解物；有机土壤中非腐植物质（主要是半纤维素、一些多肽及含氮有机物），应事先用6mol/L
HCl在90℃下降解。

但水解使HA发生较大化学变化，并损失达40%，更不适用于黄腐酸的分离和提取。

8、用离子交换树脂（或膜）、分子吸附膜从水中分离腐植酸，其中XAD-
8树脂（非离子型大孔甲基丙烯酸甲酯树脂）吸附最有效，可有效地排除糖类、肽以及化学结合的金属离子；国产的GDX-102是类似的吸附树脂。

9、用超声波处理、机械活化、物理分选等等方法对原料预处理, 均可有效提高萃取率。

用1M
HF事先处理土壤，可大大腐植酸提取率。

2.3 纯化
不同方法萃取出来腐植酸几乎都含有较多的无机质。

粗腐植酸的纯化主要是脱除无机质，俗称“脱灰”，方法有：
1、物理絮凝：在HA的碱提取液中添加适量的Na2SO4，促进细分散的无机胶体加快絮凝沉淀，通过离心或过滤，再用HCl调到pH~1.5, 加热，水洗，一般可得到灰分<5%的腐植酸；
2、化学法：1g腐植酸放入0.5ml浓HCl+0.5ml 48%HF+99ml水的混合液中,
室温下振摇24~48h，水洗到无Cl-离子。

此法可有效脱除Fe、Al、Si，使灰分降至1%以下；也可用NaOH-
H2SO4-HNO3依次处理，使无机成分先分别形成硅酸钠、偏铝酸钠、氧化铁等，再用酸溶解、沥滤；
3、黄腐酸（FA）与无机盐的分离和精制。

现有的部分技术是：1）渗析或电渗析法：用半透膜可有效分离无机盐与水溶腐植酸，但难分离络合或强吸附的腐植酸-
金属有机化合物；2）H型吸附树脂（如羧酸型Ambertite IR-120、磺酸型Dowex-
50）吸附FA，用碱液脱附FA，再用阳离子树脂吸附，用醚提取，可得低灰分的FA[91]；4）用表面活性剂吸附分离；3）用Fe3+、Al3+、Pb2+等高价金属离子沉淀FA，再用强螯合剂（如双苯硫腙）络合，在pH7的腐植酸溶液中加入阳离子表面活性剂（如溴化多米砜
DB），使其与FA形成离子对，然后抽提脱除DB；5）溶剂分离：用HCl处理腐植酸钠、水洗脱酸后，再依次用乙醇和水提取FA。

4、无论腐植酸还是黄腐酸，浓缩、干燥时最容易发生化学变化，故处理温度应<70℃，最好是减压浓缩和冷冻干燥。

2.4 IHSS土壤腐殖质综合分离法
国际腐殖质协会（IHSS）制定的土壤腐殖质的综合分离法是迄今唯一的腐植酸（HA）样品统一处理方法，基本上遵循了上述条件温和、萃取充分、溶质-溶剂无不可逆作用等原则。

操作过程如下：将土壤过2.0mm筛，按1：10（质量/体积，即M/V）加入1M
HCl，使达到pH1~2，室温下振荡1h，离心，上清液分出FA（a）。

在残留物中按1：10（M/V）加入1M NaOH，在氮气氛下混合、振荡4h，静置过夜，离心，除去残渣，用6mol/L
HCl将提取液调到pH~1，静置12h，离心，上清液分出FA（b）。

在N2气氛下将沉淀出来的腐植酸（HA）用尽量少的0.1M KOH重新溶解，高速离心，加6M
HCl调到pH~1，沉淀12~16h，离心，弃去清液，残留的HA用0.1M HCl+0.3M
HF混合液，室温下振荡过夜，离心，反复用HCl+HF处理，使HA灰分<1.0%。

再通过透析膜或透析管，使Ag NO3检测不出Cl-，冷冻干燥。

合并（a）、（b）两份黄腐酸溶液，用XAD-
8树脂吸附FA，弃去残留液，依次用0.1M NaOH和水洗脱, 流出液立即用6M
HCl调到pH~1.0，使FA仍留在溶液中。

然后将溶液通过H+饱和的离子交换树脂，冷冻干燥得H+饱和的FA。

2.5 腐植酸的分级
腐植酸类物质是分子尺寸范围极大、组成结构极其复杂的多分散体系，不少研究者致力于腐植物质的分级，即把它们尽量分成组成结构相对较窄的“级分”。

腐植酸类物质分级的方法有以下四种：
2.5.1 基于酸碱度或溶解度分级
腐植酸大分子中的活性官能团含量和分布极不均匀，导致其亲电子-
亲核两种相反的倾向产生极大差异，也就决定了它们在不同极性和pH的溶剂中具有不同的溶解性。

利用这一特性可对HA进行分级。

首先，用碱溶酸析、丙酮（乙醇）提取分级是最传统的方法：用NaOH从原料中提取，离心分离，得到腐植酸钠溶液，用HCl调到pH2~3，沉淀出来的物质为腐植酸（HA），用乙醇或丙酮溶解，可溶部分为棕腐酸，不溶部分为黑腐酸；留在盐酸溶液中的部分为黄腐酸（FA）。

在上述黄、棕、黑腐酸分级的基础上，添加各种无机盐，继续沉淀、分级，可再分出“灰腐酸”、“白腐酸”等；Kumada等在HA的碱溶液中逐渐增加乙醇的量，分离出8个HA段分，其芳香度随乙醇比例增加而降低；Theng等在HA-
K溶液中逐渐添加硫酸铵，沉淀分离出19个段分；用逐渐提高溶剂极性（非极性溶剂→偶极非质子传递溶剂→碱性溶剂）溶解的方法都可逐级分离得到若干段分。

2.5.2 基于分子尺寸的分级
目前常用的按分子尺寸分级的方法主要是凝胶过滤法,
即用交联葡聚糖凝胶（商品名Sephadex）进行分离，可将几千到几十万的有机多分散体系分为若干分子量范围的段分，但仍存在一系列问题，如电荷作用、物理化学吸附、分子聚(ju)集(ji)以及pH值、离子强度及样品浓度的影响等，都会导致偏离标定的分子尺寸，须通过选择溶剂等措施克服负面效应。

超滤技术是按原子质量单位（amu）孔径范围（1×103~
100×103amu,>1×106amu）的合成膜分离的，但也与分子电荷和分子构型有关，其中市场上销售的平板型超滤器极化作用过于强烈，容易截留大量腐植酸。

因此，有人建议选用极化作用小的中空纤维超滤器，基本上可做到按分子尺寸分级，且腐植酸分子不会发生化学变化。

超离心技术是按重力转换为分子尺寸分级的一种方法，但比较烦琐，而且分子间电荷的排斥影响很大Hayes等[96]认为添加适当的电解质可抑制这种电荷作用。

控制孔径玻璃球（CPG）（美国Electro-
Nucleonics公司产，平均孔径177Å，粒径200~400目），也是简便的尺寸分级工具，可用pH7
0.2N磷酸盐淋洗和分离腐植酸[104]。

2.5.3 基于电荷特性的分级
按该原理分级的主要是电泳技术,
它是根据带电的溶质分子在电场中运动速度差异进行分离的。

腐植酸分子多数是负电性的聚合阴离子，需溶于碱性缓冲溶液中操作，其分子迁移距离和速度与分子大小呈负相关，与电荷密度呈正相关。

电泳分级只能得到若干电荷梯度不同的组分，彼此电荷密度差别和界限不太明显。

近期有人应用等速电泳（ITP）、等电聚焦（IEF）、聚丙烯酰胺凝胶色谱（PAGE）、毛细管电泳（CE）等新的电荷分级方法有所改进，其中CE具有分离速度快、分离效率高、进样量少等优点，可以分离从离子、小分子到复杂大分子物质，已广泛用于天然HA的分离。

在CE基础上发展起来的毛细管胶束电动色谱（MECC）、毛细管等电聚焦（CIEF）、CE与质谱（MS）联用等高新技术已用于HA的分离鉴定。

2.5.4 基于吸附特性的分级
用多孔硅胶、氧化铝、活性炭、木炭等吸附-
脱附是传统的分级方法。

近期开发的大孔甲基丙烯酸甲酯XAD-
8，是分离黄腐酸类水溶有机物的有效吸附剂。

分别用有机溶剂(如氯仿、环己烷、甲醇、丁醇、甲乙酮、乙酸
乙酯等)、酸、碱或酸+醇、丙酮+水以及不同离子强度的缓冲液进行脱附，可以分为组成结构不同的段分。

不过，上述精细分离一般要将腐植酸事预先甲基化，在薄层或色谱柱上用逐级增加极性的有机溶剂冲洗而得到分级。