第三讲 量子点荧光探针

发生FRET的条件：
1)能量供体的发射光谱与能量受 体的吸收光谱必须重叠；
2)能量供体与能量受体的荧光生 色团必须以适当的方式排列；
3)能量供体、能量受体之间必须 足够接近，这样发生能量转移的 几率才会高
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C Zhang, L.W. Johnson, Anal. Chem. 2009, 81: 3051–3055
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QDs应用于生物传感器
CdSe/ZnS与有机磷水解蛋白（OPH）通过静电作用偶联，测 定对氧磷。
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X Ji, J Zheng, K. R. Vipin, M. L. Roger. J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 3793-3799
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QDs基于FRET研究生物分子间相互作用
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量子点又称为半导体纳米晶（nanocrystals，NCs）、 半导体纳米粒子（nanoparticles，NPs）
单量子点：Au，Pd，Co等；
量子点 种类
Ⅱ-Ⅵ族：CdSe，CdTe，ZnS，MgSe等； Ⅲ-Ⅴ族：GaAs，InAs，GaSb等； Ⅳ-Ⅳ族：SiC，SiGe； Ⅳ族：Si，Ge； Ⅳ-Ⅵ族：PbSe；
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量子点的应用
光电子学方面的应用：电致发光的光电子器件 80s后期，生物学家开始关注量子点在生物学方面的应用； 1998年，Alivisatos和Nie研究小组的工作： 半导体量子点在生物学研究的应用取得重大突破。
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量子点在生物上的应用
广激发谱，窄发射谱
传统荧光素
量子点
(A) Excitation ( dashed) and fluorescence ( solid) spectra of
以分闸法产生 GaAs/AlGaAs量 子点之SEM影像
量子点的制备方法小结
合
Top-down 晶体表面
成
刻蚀
方
法
Bottom-up 化学制
备
波长范围宽，发射峰尖锐 ，发射波长可以通过纳米 粒子粒径调节，易于自组 织
组成器 件
生物体系 标记
量子点的光学特性
宽吸收峰：能吸收所有比它第一发射波长更短的“较蓝”的光。 窄发射峰：具有非常窄且十分对称的荧光发射光谱。 大斯托克斯位移：消除激发光和散射光等背景干扰。
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量子点在生物上的应用
➢单个波长可激发所有的量子点，而不同染料分子的 荧光探针需多个激发波长。 ➢应用范围广：可用于多领域和多仪器 ➢多种颜色：颜色取决于量子点的大小，在同一激发 波长下，可发出多种激发光，达到同时检测多种指标 的要求。 ➢抗光致漂白性 ➢安全：细胞毒性低，可用于活细胞及体内研究 ➢荧光时间长：荧光时间较普通荧光分子长数千倍， 便于长期跟踪和保存结果
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QDs用于非同位素标记生物分子的超灵敏检测
QDs表面连接上巯基乙酸（HSCH2COOH),从而使量子点既具 有水溶性，还能与生物分子（如 蛋白质、多肽、核酸等）结合， 然后通过光致发光检测出QDs， 从而使生物分子识别一些特定的 物质。
CdSe：发光核心 Zns：包壳 它们是在有机溶剂中制备的，不溶于水，无生物亲和 性。 巯基集团作用： S与ZnS包壳中Zn 原子结合，而有机集团与蛋白质结合 ，这样量子点探针就溶于水，且有生物亲和性了。 23
fluorescein; (B) A typical water-soluble nanocrystal sample in
PBS 激发光-虚线；发射光-实线；半峰高宽度：67nm vs. 32nm；10%峰高宽度：100nm vs. 67nm；量子点光谱优点： 无红外延伸，连续、宽激发谱
发射光波长易调节
是临床医学上鉴别某些生物标志的重要生物技术手段。
同时分析多 种荧光物质
？ 有机荧光染
料 量子点
量子点与免疫球蛋白IgG结合，再捕捉抗原
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Goldman等人用四种不同颜色的量子点分别于抗霍乱毒素、蓖麻 毒素、志和菌毒素1和葡萄球菌肠毒素B的抗体偶联，在一个微孔 板上实现了四种毒素的同时检测。
Goldman E R, Clapp A R, Anderson G P. AnaL Chem, 2004, 76(3): 684
4、在量子点表面修饰带负电荷的基团，通过电荷作用力与 带正电的生物分子结合
5、将量子点并入带空隙的微珠或纳米级的微球中，形成 胶囊，再通过双功能试剂将微球与生物分子连接
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➢ 生物成像 ➢ 荧光免疫分析 ➢ 生物芯片 ➢ 生物传感器 ➢ 基于FRET研究生物分子间作用
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QDs用于生物成像技术
量子点研究的历史
70 年代，量子点由于其独特的光学特性,认为其应用 主要集中在电子与光学方面。
80 年代，生物学家已经对量子点产生了浓厚的兴趣 ，但由于它的荧光量子产率低，工作集中在研究量子 点的基本特性方面。
1997 年以来，量子点制备技术的不断提高, 量子点已 越来越可能应用于生物学研究。
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活体成像
c.包含各种量子点的不同颜色的微珠被注射到小鼠体内用于 活体成像 d.用连接有抗体的红色量子点进行小鼠活体内前列腺癌细胞 的特异性标记和成像 X Gao, M L. Richard, Shuming Nie. Nat. Biotechnol, 2004, 22: 959-960
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QDs用于免疫分析
科学家已经发明许多不同的方法来制造 量子点，并预期这种纳米材料在21世纪的 纳米电子学上有极大的应用潜力。
nanoelectronics
量子点可用来作激光器的工作物质
quantum confinement effect
什么是量子点？
✓ 若要严格定义量子点，则必须由量子力学 出发。电子的物质波特性取决于其费米波 长。
量子点的制备方法
✓ 3.微影蚀刻法(lithography and etching)：以光束或 电子束直接在基材上蚀刻制作出所要之图案，由于相当费 时因而无法大量生产。
以 GaAs 基 材 蚀 刻窄圆柱式量 子 点 之 SEM 影 像，水平线条 约0.5微米
量子点的制备方法
✓ 4.分闸法(split-gate approach) ：以外加电压的方式在 二维量子井平面上产生二维局限，可控制闸极改变量子点 的形状与大小，适合用于学术研究，无法大量生产。
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量子点的表面修饰与生物功能化
1、使用双功能试 剂，与量子点表 面金属离子配合
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2、表面修饰有三正辛 基氧化磷（TOPO） 的量子点先与双亲聚 合物的疏水长链以疏 水作用力相结合，再 通过聚合物的亲水基 团与生物分子连接
3、对量子点表面 进行硅烷化处理， 并嵌入可与生物分 子连接的官能团
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3
什么是量子点？
量子点是准零维的纳米材料，由少量 的原子所构成。粗略的说，量子点的三个 维度的尺寸都在100纳米以下，外观恰似 一极小的点状物，其内部电子在各方向上 的运动都受到局限，所以量子局限效应特 别显著。由于量子局限效应会导致类似原 子的不连续电子能级结构，因此量子点又 被称为“人造原子”。
基于QDs与生物分子间的特异性相互作用 构建量子点-生物复合探针 特异性靶向作用 保持荧光强度及稳定性 减少其他分子非特异性吸附
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量子点的制备
Top-down 晶体表面刻蚀
组成器件
Bottom-up 化学制备
有机相制备 水相制备
生物标记
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前驱体
阳离子：Zn2+、Cd2+等； 阴离子：Te2-、Se2-等。
稳定剂：巯基乙酸、巯基乙醇、2-硫代二乙醇、 左旋半胱氨酸等
ie：在绝氧的条件下，向以巯基乙酸为稳定剂的 CdCl2溶液中引入H2Te气体，通过高温或微波，使 量子点快速成核及生长。
形成的量子点类型：CdSe传统核型，CdSe-CdS 核-壳型，CdTe-CdS-ZnS核-壳-壳型，Eu掺杂 CdSe
A
original QDs
裸量子点
B
mercapto-solubilized QDs 结合巯基
C
结合了巯基
QD-IgG conjugates 蛋白质
转铁蛋白与量子点共价交联，在受体的 介导下发生内吞作用，转移至HeLa细胞 中，证明连接的量子点仍具有生物活性。
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两个创新点： 发挥QDs的水溶性 将QDs与生物分子的偶联
第三讲 量子点荧光探针
量子点概述
当半导体材料降至一定临界尺寸后，电子在三维 上的运动受到了限制，表现出量子局限效应。这类材 料都称为量子点（quantum dots，QDs）
量子局限效应导致费米能级附近的电子能级由连 续变为离散能级或能隙变宽，具有类似分子特性的分 立能级结构，受激后可以发射荧光。
wk.baidu.com
染色稳定性
QDs用于荧光生物标记
采用两种QDs标记3T3小鼠 纤维原细胞。 一种发绿色荧光（2nm）： 经TEOS、尿素及乙酸作用 后，对细胞核具有很强亲 和力； 一种发红色荧光（4nm）： 表面经生物素修饰后，与 亲和素修饰的肌动蛋白丝 发生特异性吸附。
M. Bruchez, M. Moronne, P. Gin, Weiss, A. Alivisatos. Science. 1998, 281: 2013-2016.
量子点的制备方法
✓ 2. 自 组 成 法 (self-assembly method) ： 采 用 分 子 束 磊 晶 (molecular-beam epitaxy) 或 化 学 气 相 沉 积 (chemical vapor deposition) 过 程 ， 并 利 用 晶 格 不 匹 配 (lattice mismatch) 的原理，使量子点 在特定基材表面自聚生长，可 在GaAs基材上以自组成法生长 大量生产排列规则的量子点。 InAs量子点的STM影像
Wu等将CdSe/ZnS量子点与羊抗鼠IgG或链霉素结合，并将其作 为二抗与抗Her2的单体克隆抗体进行免疫反应，从而实现乳腺 癌细胞的特异性检测。 Wu X, Liu H, Liu J, Nat Biotechnol, 2003, 21（1）: 41-46
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组织成像
a.PEG-coated CdSe/ZnS量子点标记的小鼠肺部：血管、肿 瘤细胞、肿瘤中的血管和淋巴管 b.近红外荧光QDs被前哨淋巴结吸收。 Kim S, Lim Y T, Soltesz E G. Nat. Biotechnol. 2004, 22:93-97
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QDs应用于生物芯片技术
量子点色彩的多样性满足了对生物高分子（蛋白质、DNA）所蕴含海 量信息进行分析的要求
将聚合物和量子点结合形成 聚合物微珠，微珠可以携带 不同尺寸（颜色）的量子点， 被照射后开始发光，经棱镜 折射后传出，形成几种指定 密度谱线（条形码），这种 条形码在基因芯片和蛋白质 芯片技术中有光明的应用前 景。
什么是量子点？
由此可见，并非小到100nm以下的材料就是量子点，真正的关 键尺寸是由电子的德布罗意波长或平均自由程。
一般而言，电子费米波长在半导体内较在金属内长得多，例如 在半导体材料砷化镓GaAs中，费米波长约40nm，在铝金属中却 只有0.36nm。
量子阱、量子线及量子点能 级比较关系示意图
量子点可作为生物探针是从1998年Alivisatos AP. 和 Chan WC两个研究小组开始，此后量子点的功能进一 步被发现、推广，使之成为生物学领域研究的热点。
量子点的制备方法
目前，量子点的制备方法主要有 以下四种.
✓ 1.化学溶胶法(chemical colloidal method)：以化学溶胶 方式合成，可制作复层量子点 (multilayered)，过程简单，且 可大量生产。
✓ λF = 2π / kF ✓ 在一般的材料中，电子的波长远小于材料
的尺寸，因此量子局限效应不显著。如果 将某一个维度的尺寸缩到小于一个波长， 此时电子只能在另外两个维度所构成的二 维空间中自由运动，这样的系统我们称之 为量子阱；如果我们再将另一个维度的尺 寸缩到小于一个波长，则电子只能在一维 方向上运动，我们称之为量子线；当三个 维度的尺寸都缩到一个波长以下时，就成 为量子点了。
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光稳定性：抵抗紫外、化学物质、生理代谢对其的降解。 安全：细胞毒性低，可用于活细胞及体内研究。 高量子效率：荧光强度大，发光时间长，便于长期跟踪和保存结果。
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发射波长尺寸可调：通过控制量子点大小或组成合成任意所需发 射波长的量子点，达到同时检测多种指标的要求。
独特优越的光学、电子和表面可修饰性！