四川大学基因工程原理ppt

β—半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5'-端可容许很大的变化而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大
LacZ基因的结构与产物
P LacZα LacZβ 转录 翻译
α
β
pUC18
外源DNA
BamHI片段
重组DNA分子 转化E.coli
1）标记基因与宿主细胞 2）标记基因产物的作用机制: Apr
3）标记基因的结构与适用范围: 基因启动子, 翻译起始
序列, 密码子偏爱性
4）标记基因的结构变化对功能的影响: LacZ, GUS
4. 常用的遗传标记基因
1) 四环素抗性基因（Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质 分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码 一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。
pUC19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
Ap r
利 用 菌 落 颜 色 筛 选 重 组 子
1)限制酶切
2)DNA重组 无DNA插入
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
Apr
提取DNA 电泳
重组DNA Ap r
1)限制酶切
2)DNA重组 无DNA插入
外源DNA 有DNA插入
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r
Tcr
转化
Amp r Tc s
外源DNA
Amp r Tcr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
7）荧光素酶基因
荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶， 并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10 倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧 光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的 变化测定酶活。
8）发光蛋白质基因
发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白 质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。
利 用 抗 生 素 抗 性 基 因 筛 选 重 组 子 的 过 程
BamHI片段(Tcr)
pBR322
PstI(Apr)片段 重组分子Ⅱ(Aps Tcr) 重组分子I (Apr Tcs）
PstI片段
外源DNA
BamHI片段 重组分子I 重组分子Ⅱ 分别转化E.coli (ApS TcS) 涂布Ap平板 涂布Tc平板 Apr转化子 Tcr转化子
P S S P
B E H
噬菌体 M13 衍生的 载体
mp8 mp9 mp11 mp18 mp19
H P S
B Sm E H
E SI Sm B Xb S P H P S
Xb B Sm SI E Sp H
E SI K Sm B Xb S
MCS
lacZ laci'
I.R
II
M13mp载体 M13(6407 bp)
例子: pBR322和pUC载体。 上述两例中的非重组子来源有两个：
a. 酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子
b. 酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子
普通型载体pBR322的结构图
HindIII BamHI PstI SalI ScaI Amp
r
pBR322
(4.36 kb)
ori
例：大肠杆菌（E.coli）的噬粒（phagemid）载体既含有 来自质粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13） 的复制起点。在不同条件下，它可以质粒或噬菌体 的复制起点进行复制，从而获得质粒ds- DNA或噬菌 体ss –DNA 又如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的某些载体 既含有质粒（2μ）复制起点，又含有ARS片段 b. 不同生物复制起点混合—穿梭载体（shuttle vector）
2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
2. 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r， Hygr ，Neor b. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cd r c. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因
β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性， 装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和 β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性； 只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为 α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编 码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个 基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。
ori
大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体
E P
YRp12
ori
E
r
(6.9 kb)
Tc
B
五、分子克隆载体的复制起点种类、标记基 因与拷贝数的关系
1. 复制起点种类与拷贝数间的关系
1) 质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies，受 宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，>20 copies， 受宿主染色体控制较弱） 2) ARS型载体：拷贝数较高（约20 copies） 3) 病毒型复制起点：高拷贝
4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因
Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡 萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。 来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生 素磷酸化，使之不能进入细胞内。
5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα）
两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式 存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在
* 穿梭载体范围：细菌—细菌（放线菌），细菌—酵 母菌， 细菌—真菌，细菌—动物
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
2）营养标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成 酶类的基因， 这类基因在酵母转化中使用最频繁，如 TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。
3）生化标记基因
其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ, GUS, CAT
4） 噬菌斑
3. 使用标记基因注意要点
一、根据载体的分子生物学特性划分
1. 质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制 2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA 分子，形成病毒颗粒 3.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的 转换依赖于宿主细胞生物学特性
LacZ
GGATTC
EcoRI GGATCC
mp2 mp7
E B S E Sm B
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
提取DNA 电泳
Amp r Tc s
重组DNA
pUC18和pUC19载体
pUC18
HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI
EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
2) 氨苄青霉素抗性基因（Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的 活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶， 催化β—内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。
3) 氯霉素抗性基因（Cmr）
Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白 质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰 化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。
1. 影响转化频率的因素
1) 复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点 2) 标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因
2. 影响稳定性的因素
1) 复制起点类型—低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳 定性差 2) 选择压力 3) 载体在宿主细胞中的状态—自主复制型和整合型 宿主细胞的遗传特性和生理特性
第二节
分子克隆载体的种类
HindIII BamHI
大肠杆菌载体
PstI SalI ScaI Amp
r
pBR322结构图
pBR322
(4.36 kb)
ori
三、遗传标记基因
1. 标记基因的作用
1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入 宿主细胞
这种指示可以是选择性的（Apr ，Tcr ，Kanr）， 也可以是非选择性的（如lacZ） * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选 择性的（如TcS， lacZα, GUS），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第 一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用 时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的 基因是不能用作选择性标记基因（lacZ，GUS等）。
2. 标记基因与拷贝数的关系
若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生 标记基因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。 对于不同标记基因，可采取相应方法提高其拷贝数。 如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。 对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其 他低效率的标记基因
六、分子克隆载体的转化频率和稳定性
转染
筛选重组噬菌体 无色噬菌斑
提取DNA 电泳
重组DNA
利 用 噬 菌 斑 颜 色 筛 选 重 组 子
2. 表达型载体（expression vector）
1) 特点:
a. 基因的启动子序列和终止子序列； b. 一般无检测标记基因； c. 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）； d. 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。
四、分子克隆载体的复制起点与种类
1. 复制起点的种类
1) 核内复制起点 a. 染色体复制起点—原核生物(环状)和真核生物(线 状)染色体 b. 染色体外复制起点 i. 质粒—DNA,RNA,线状,环状,单链,双链 原核与真核生物 ii. 病毒—同上, 细胞内和病毒颗粒内 2) 核外复制起点 a. 线粒体—所有真核细胞 两种质体中亦可能含有质粒 b. 叶绿体—所有绿色植物细胞
第一节
分子克隆载体的特点
一、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的
利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建
立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列 载体。
V VI I VI IX II VI
II I
X
IV I
二、根据载体功能划分
1. 普通型载体
1) 特点: 至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，
其中一 个用于转化体选择，另一个用于重组 子检测。2) 用途: 基因组或cDNA的构建;次克隆(subcloning)
或限制酶谱分析；外源DNA扩增。
BamHI片段
利用LacZ基因筛选重组子
涂布在含X-Gal 和Ap的平板上, 白色菌落为重组 子，兰色菌落为 原载体
6）葡萄糖苷酸酶基因（GUS）
该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物 的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外， 它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。
第二章
分子克隆载体
2001年10月17日
分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携 带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。 本章主要讲授内容：
分子克隆载体的特点; 分子克隆载体的种类; 大肠杆菌分子克隆载体; 细菌和链霉菌的分子克隆载 体；真菌分子克隆载体；植物克隆载体； 动物分子克隆载体； 克隆载体的选择；克隆载体的组建
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克
隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7， sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。
二、载体特点
1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物 体中自主复制。 2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重 组DNA分子是否进入宿主细胞
3. 按复制起点划分克隆载体
1) 质粒复制型—复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体
2) ARS复制型—ARS（autonomus replicative
sequence)，或称染色体复制型 3) 病毒复制型—复制起点来自病毒，若为RNA病毒， 必须反转录为cDNA。 4) 混合复制型 a. 同种生物复制起点混合—质粒形式存在；质粒或 病毒形式存在