乳腺癌患者血清差异表达蛋白分析
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可治愈阶段检测出疾病及时提供较好的治疗方案是降低死 亡率的重要途径。早期乳腺癌 90% 可以治愈。 中晚期患者 因大部分己发生淋巴或血行转移， 其 5 年生存率只有 70% 和 45% ［3］ ， 因此， 乳腺癌的早诊断早治疗尤为重要 。 近年来随 着蛋白质组学技术的发展应用， 利用蛋白质组学手段寻找肿 ［4 ］ 瘤标志物， 大大提高了诊断的灵敏度和特异性 。 采用液体 芯片磁柱分离系统结合基质辅助激光解析电离化 / 飞行时间 质谱 （ matrix assisted laser desorption ionization / time of flight MS， MALDI － TOF MS） 技术以及 Clin Prot 系统对我国早期乳 腺癌患者人群进行分析研究：通过对比分析早期乳腺癌患者 与正常人群的血清蛋白多肽图谱的差异， 寻找出乳腺癌患者 与正常人群组间有统计学明显差异的峰图， 从而筛查出早期 乳腺癌患者血清特异表达的蛋白多肽 。 1 1． 1 1． 1． 1 材料与方法 研究材料 样本的采集与处理 采集陕西省肿瘤医院乳腺科
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朱
江， 等
乳腺癌患者血清差异表达蛋白分析
乳腺癌患者血清差异表达蛋白分析
朱 江， 邓智平， 韩丕华， 宋张骏
Analysis of differential expressed protein from breast cancer patient serum
Zhu Jiang， Deng Zhiping， Han Pihua， Song Zhangjun
。
因为当前乳腺癌尚无明确的病因干预措施， 所以在早期
【收稿日期】 2014 － 04 － 23 【修回日期】 2014 － 05 － 19 【基金项目】 陕西省科技厅社会发展攻关计划项目（ 编号：2013K12 － 03 － 16 ） 【作者单位】 陕西省肿瘤医院乳腺科， 陕西 西安 710061 【作者简介】 朱江（ 1972 － ） ， 男， 安徽合肥人， 副主任医师， 硕士研 究生， 主要从事乳腺肿瘤研究及临床诊治 。 E － mail： zhudaifu19@ sina． com
现代肿瘤医学 2014 年 9 月
来自百度文库
第 22 卷第 9 期
MODEＲN ONCOLOGY， Sep. 2014 ， VOL. 22 ， NO. 09
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2012 年 6 月 － 2013 年 1 月期间的 50 例女性乳腺癌患者术前 血清标本， 均经病理确诊， 术前均未行放化疗。 年龄 29 － 78 岁， 平均年龄 53． 57 岁， 中位年龄 55 岁。 健康对照组为陕西 省肿瘤医院体检正常的女性， 身体健康， 既往无乳腺癌发病史， 共 采集血清样本50 例， 年龄 27 － 77 岁， 平均年龄为 49． 61 岁， 中 位年龄 48 岁。样本考虑性别、 年龄、 采集时间、 储存条件是 否一致、 有无基础疾病等因素， 两组间比较无显著性差异 。 血清样品的实验使用均得到了患者的知情同意 。 被采集者 晨起空腹采血， 用真空采血管 （ 黄帽、 有隔离胶） 采 集 全 血 5ml， 室温静置 30min；室温离心 5min （ 3000r / min ） ， 将上层血 清分装成 100 μl / 管， 立即保存于 － 80℃ ， 避免反复冻融。 1． 1． 2 试 剂 与 仪 器 血 清 蛋 白 提 取 采 用 的 试 剂 为 德 国 Bruker － Dalton 公司的磁珠试剂盒—弱阳离子磁珠（ magnetic beads based weak cation exchange， MB － WCX ） ， 以及光谱纯 （ HPLC 级） 乙腈（ acetonitrile， ACN ） 、 三氟乙酸（ trifluoroacetic acid， TFA） （ 德国 Merck 公司） 、 α － 氰基 － 4 － 羟基肉桂酸（ α － cyano － 4 － hydroxycinnamic acid， HCCA ） （ 美 国 Sigma 公 MBS ） 、 600 / 司） 。 磁 珠 分 离 器 （ magnetic nead separator， 384Anchor Chip 靶板和 Auto Flex Ⅲ MALDI － TOF － MS （ 德 国 Bruker 公司） 。 1． 2 研究方法 1． 2． 1 血清蛋白样本的制备 处理步骤： ① 将磁珠试剂盒 从恒温 4℃ 保存的冰箱中取出， 从中将弱阳离子的磁珠悬浮 液取出， 并用混匀器将其完全混匀 1min； ② 在 200 μl 的样品 管中用加样枪注入 10 μl 的磁珠结合缓冲液（ BS ） ， 然后把弱 阳离子磁珠 10 μl 注入， 上下吹打， 用加样枪来混匀并尽量防 止起泡；③向样品管加 5 μl 血清， 用加样枪上下吹打混匀， 避 免起泡， 至少 5 次；④在室温下静置 5min；⑤把样品管置于磁 珠分离器里 1min， 使磁珠从悬浮液中分离出来贴于样品管壁 上， 液体变清澈；⑥将上清液用加样枪吸弃， 小心避免枪头接 触到样品管壁上， 以免将磁珠吸走； ⑦ 将 100 μl 磁珠的清洗 缓冲液（ WB） 加入到样品管里； ⑧ 反复在磁珠分离器的前后 相邻两孔间移动样品管 10 次； ⑨ 把样品管置于磁珠分离器 里 1min， 使磁珠从悬浮液中分离出来贴于样品管壁上， 液体 变清澈；⑩将上清液用加样枪吸弃， 小心避免枪头接触到样 品管壁上， 以免将磁珠吸走； 瑡 重复 7 － 10 步骤两次， 瑏 最后将 悬浮液完全吸弃； 瑢将 5 μl 磁珠的洗脱缓冲液（ ES） 加入样品 瑏 管里， 用加样枪上下反复吹打 10 次并尽量防止起泡， 混匀贴 壁的磁珠； 瑣把样品管置于磁珠分离器里 2min， 瑏 让磁珠与悬 浮液完全分离后， 将上清液移入 0． 5ml 的干净样品管里； 瑤 瑏 将 5 μl 的磁珠稳定缓冲液（ SS ） 加入到样品管中， 小心用加 样枪来吹打混匀； 瑏 瑥然后再加入磁珠稳定缓冲液的洗 脱 液 1 μl， 即可以用于 MALDI － TOF MS 检测分析。 1． 2． 2 质谱分析 将分离收集得到的蛋白样本 1 μl 与 10 μl 的基质 α － 氰基 － 4 － 羟基肉桂酸混匀， 取 1 μl 点在 Anchorchip 靶板上， 每个样本分别点三个靶点以作三次重复 。 待室 温干燥后将靶板放入质谱仪进行飞行时间质谱分析， 采用 Flex Control 2． 0 软件进行标准品校正后开始样本检测， 每个 样本要经过总共 300 次激光打靶（ 5 次点靶， 每次打靶 2 × 30 次） 之后生成质图谱， 获得由不同质核比（ m / z ） 组成的蛋白 多肽图谱。采用 Clin Pro Tools 2． 1 软件结合遗传算法等生 物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽 图谱。分析组间差异蛋白并计算差异大小， 按差异大小由
Department of Mastopathy， Shaanxi Provincial Tumor Hospital， Shaanxi Xi＇an 710061 ， China． 【Abstract】 Objective： To discover potential biomarkers in serum for the detection of breast cancer （ BC ） ． Methods：All 100 serum samples including 50 BC patients and 50 healthy controls were analyzed using Clin Prot system combined with matrix － assisted laser desorption / ionization time － of － flight masss spectrometry （ MALDI － TOF － MS ） ． Clin Prot software and genetic algorithm analysis selected a panel of serum markers that most efficiently predicted BC． Ｒesults：By analyzing the spectra（ screened from two groups） using the Clin Pro Tools software， 11 of all 78 peaks generated were significant differently expressed（ P ＜ 0． 001 ） between two groups． And 6 peaks were up － expressed while other 5 peaks were down － expressed in BC patients． The two max differential expressed peaks were m / z： 4957． 03 and m / z：4600． 01． Conclusion： We can identify proteomic patterns that could clearly distinguish between BC patients and healthy controls based on MALDI － TOF － MS analysis． 【Key words】 MALDI － TOF － MS；breast cancer；serum proteomics；biomarkers Modern Oncology 2014 ， 22 （ 09 ） ：2082 － 2085 BC） 患者的血清蛋白多肽图谱， 【摘要】 目的：检测乳腺癌（ breast cancer， 分析乳腺癌患者与正常对照人群的 蛋白表达差异， 筛查其可作为潜在标记物的差异表达蛋白多肽 。 方法： 采用液体芯片磁柱分离系统结合基质 MALDI － TOF 辅助激光解析电离化 / 飞行时间质谱（ matrix assisted laser desorption ionization / time of flight MS， MS） 技术对 50 例病理确诊的早期乳腺癌患者和 50 例正常对照人群进行血清蛋白组分析 。 采用 Clin Pro Tools 软件进行蛋白多肽的组间差异对比 。 结果： 在分子量范围 1000 － 10000Da 共检测到 78 个蛋白多肽峰 图， 其中 11 个蛋白多肽峰图具有极显著差异（ P ＜ 0． 001 ） ， 它们中有 5 个蛋白多肽在乳腺癌患者中表达下调， 其余 6 个蛋白多肽在乳腺癌患者中表达上调 。其中， 质核比（ m / z） 为： 4957． 03 以及 4600． 01 ， 在乳腺癌患者 组与正常对照人群血清中为最大差异表达的蛋白多肽 。 结论： 利用液体芯片 － 飞行时间质谱技术以及 Clin Prot 系统可捕获到丰富且稳定的乳腺癌患者血清蛋白多肽图谱并能筛选出多个组间显著差异表达的蛋白多 肽， 可作为乳腺癌临床辅助诊断的潜在疾病标志物 。 【关键词】 液体芯片 － 飞行时间质谱；乳腺癌；血清蛋白组；疾病标志物 【中图分类号】 Ｒ737． 9 【文献标识码】 A DOI：10． 3969 / j． issn． 1672 － 4992． 2014． 09． 24 【文章编号】 1672 － 4992 － （ 2014 ） 09 － 2082 － 04 乳腺癌是女性较常见的恶性肿瘤之一， 全世界每年约有 120 万妇女患病， 50 万人死亡。 在美国及其他西方国家， 乳 腺癌发病率位于女性恶性肿瘤的第一位， 中国虽然是乳腺癌 的相对低发地区， 但随着生活方式的改变， 城市化进程加快， 近年来乳腺癌发病率正逐年增加， 已成为城市中死亡人数增 长较快的癌症之一
可治愈阶段检测出疾病及时提供较好的治疗方案是降低死 亡率的重要途径。早期乳腺癌 90% 可以治愈。 中晚期患者 因大部分己发生淋巴或血行转移， 其 5 年生存率只有 70% 和 45% ［3］ ， 因此， 乳腺癌的早诊断早治疗尤为重要 。 近年来随 着蛋白质组学技术的发展应用， 利用蛋白质组学手段寻找肿 ［4 ］ 瘤标志物， 大大提高了诊断的灵敏度和特异性 。 采用液体 芯片磁柱分离系统结合基质辅助激光解析电离化 / 飞行时间 质谱 （ matrix assisted laser desorption ionization / time of flight MS， MALDI － TOF MS） 技术以及 Clin Prot 系统对我国早期乳 腺癌患者人群进行分析研究：通过对比分析早期乳腺癌患者 与正常人群的血清蛋白多肽图谱的差异， 寻找出乳腺癌患者 与正常人群组间有统计学明显差异的峰图， 从而筛查出早期 乳腺癌患者血清特异表达的蛋白多肽 。 1 1． 1 1． 1． 1 材料与方法 研究材料 样本的采集与处理 采集陕西省肿瘤医院乳腺科
· 2082·
朱
江， 等
乳腺癌患者血清差异表达蛋白分析
乳腺癌患者血清差异表达蛋白分析
朱 江， 邓智平， 韩丕华， 宋张骏
Analysis of differential expressed protein from breast cancer patient serum
Zhu Jiang， Deng Zhiping， Han Pihua， Song Zhangjun
。
因为当前乳腺癌尚无明确的病因干预措施， 所以在早期
【收稿日期】 2014 － 04 － 23 【修回日期】 2014 － 05 － 19 【基金项目】 陕西省科技厅社会发展攻关计划项目（ 编号：2013K12 － 03 － 16 ） 【作者单位】 陕西省肿瘤医院乳腺科， 陕西 西安 710061 【作者简介】 朱江（ 1972 － ） ， 男， 安徽合肥人， 副主任医师， 硕士研 究生， 主要从事乳腺肿瘤研究及临床诊治 。 E － mail： zhudaifu19@ sina． com
现代肿瘤医学 2014 年 9 月
来自百度文库
第 22 卷第 9 期
MODEＲN ONCOLOGY， Sep. 2014 ， VOL. 22 ， NO. 09
· 2083·
2012 年 6 月 － 2013 年 1 月期间的 50 例女性乳腺癌患者术前 血清标本， 均经病理确诊， 术前均未行放化疗。 年龄 29 － 78 岁， 平均年龄 53． 57 岁， 中位年龄 55 岁。 健康对照组为陕西 省肿瘤医院体检正常的女性， 身体健康， 既往无乳腺癌发病史， 共 采集血清样本50 例， 年龄 27 － 77 岁， 平均年龄为 49． 61 岁， 中 位年龄 48 岁。样本考虑性别、 年龄、 采集时间、 储存条件是 否一致、 有无基础疾病等因素， 两组间比较无显著性差异 。 血清样品的实验使用均得到了患者的知情同意 。 被采集者 晨起空腹采血， 用真空采血管 （ 黄帽、 有隔离胶） 采 集 全 血 5ml， 室温静置 30min；室温离心 5min （ 3000r / min ） ， 将上层血 清分装成 100 μl / 管， 立即保存于 － 80℃ ， 避免反复冻融。 1． 1． 2 试 剂 与 仪 器 血 清 蛋 白 提 取 采 用 的 试 剂 为 德 国 Bruker － Dalton 公司的磁珠试剂盒—弱阳离子磁珠（ magnetic beads based weak cation exchange， MB － WCX ） ， 以及光谱纯 （ HPLC 级） 乙腈（ acetonitrile， ACN ） 、 三氟乙酸（ trifluoroacetic acid， TFA） （ 德国 Merck 公司） 、 α － 氰基 － 4 － 羟基肉桂酸（ α － cyano － 4 － hydroxycinnamic acid， HCCA ） （ 美 国 Sigma 公 MBS ） 、 600 / 司） 。 磁 珠 分 离 器 （ magnetic nead separator， 384Anchor Chip 靶板和 Auto Flex Ⅲ MALDI － TOF － MS （ 德 国 Bruker 公司） 。 1． 2 研究方法 1． 2． 1 血清蛋白样本的制备 处理步骤： ① 将磁珠试剂盒 从恒温 4℃ 保存的冰箱中取出， 从中将弱阳离子的磁珠悬浮 液取出， 并用混匀器将其完全混匀 1min； ② 在 200 μl 的样品 管中用加样枪注入 10 μl 的磁珠结合缓冲液（ BS ） ， 然后把弱 阳离子磁珠 10 μl 注入， 上下吹打， 用加样枪来混匀并尽量防 止起泡；③向样品管加 5 μl 血清， 用加样枪上下吹打混匀， 避 免起泡， 至少 5 次；④在室温下静置 5min；⑤把样品管置于磁 珠分离器里 1min， 使磁珠从悬浮液中分离出来贴于样品管壁 上， 液体变清澈；⑥将上清液用加样枪吸弃， 小心避免枪头接 触到样品管壁上， 以免将磁珠吸走； ⑦ 将 100 μl 磁珠的清洗 缓冲液（ WB） 加入到样品管里； ⑧ 反复在磁珠分离器的前后 相邻两孔间移动样品管 10 次； ⑨ 把样品管置于磁珠分离器 里 1min， 使磁珠从悬浮液中分离出来贴于样品管壁上， 液体 变清澈；⑩将上清液用加样枪吸弃， 小心避免枪头接触到样 品管壁上， 以免将磁珠吸走； 瑡 重复 7 － 10 步骤两次， 瑏 最后将 悬浮液完全吸弃； 瑢将 5 μl 磁珠的洗脱缓冲液（ ES） 加入样品 瑏 管里， 用加样枪上下反复吹打 10 次并尽量防止起泡， 混匀贴 壁的磁珠； 瑣把样品管置于磁珠分离器里 2min， 瑏 让磁珠与悬 浮液完全分离后， 将上清液移入 0． 5ml 的干净样品管里； 瑤 瑏 将 5 μl 的磁珠稳定缓冲液（ SS ） 加入到样品管中， 小心用加 样枪来吹打混匀； 瑏 瑥然后再加入磁珠稳定缓冲液的洗 脱 液 1 μl， 即可以用于 MALDI － TOF MS 检测分析。 1． 2． 2 质谱分析 将分离收集得到的蛋白样本 1 μl 与 10 μl 的基质 α － 氰基 － 4 － 羟基肉桂酸混匀， 取 1 μl 点在 Anchorchip 靶板上， 每个样本分别点三个靶点以作三次重复 。 待室 温干燥后将靶板放入质谱仪进行飞行时间质谱分析， 采用 Flex Control 2． 0 软件进行标准品校正后开始样本检测， 每个 样本要经过总共 300 次激光打靶（ 5 次点靶， 每次打靶 2 × 30 次） 之后生成质图谱， 获得由不同质核比（ m / z ） 组成的蛋白 多肽图谱。采用 Clin Pro Tools 2． 1 软件结合遗传算法等生 物统计学和生物信息学方法分析两组血清样本的蛋白多肽 图谱。分析组间差异蛋白并计算差异大小， 按差异大小由
Department of Mastopathy， Shaanxi Provincial Tumor Hospital， Shaanxi Xi＇an 710061 ， China． 【Abstract】 Objective： To discover potential biomarkers in serum for the detection of breast cancer （ BC ） ． Methods：All 100 serum samples including 50 BC patients and 50 healthy controls were analyzed using Clin Prot system combined with matrix － assisted laser desorption / ionization time － of － flight masss spectrometry （ MALDI － TOF － MS ） ． Clin Prot software and genetic algorithm analysis selected a panel of serum markers that most efficiently predicted BC． Ｒesults：By analyzing the spectra（ screened from two groups） using the Clin Pro Tools software， 11 of all 78 peaks generated were significant differently expressed（ P ＜ 0． 001 ） between two groups． And 6 peaks were up － expressed while other 5 peaks were down － expressed in BC patients． The two max differential expressed peaks were m / z： 4957． 03 and m / z：4600． 01． Conclusion： We can identify proteomic patterns that could clearly distinguish between BC patients and healthy controls based on MALDI － TOF － MS analysis． 【Key words】 MALDI － TOF － MS；breast cancer；serum proteomics；biomarkers Modern Oncology 2014 ， 22 （ 09 ） ：2082 － 2085 BC） 患者的血清蛋白多肽图谱， 【摘要】 目的：检测乳腺癌（ breast cancer， 分析乳腺癌患者与正常对照人群的 蛋白表达差异， 筛查其可作为潜在标记物的差异表达蛋白多肽 。 方法： 采用液体芯片磁柱分离系统结合基质 MALDI － TOF 辅助激光解析电离化 / 飞行时间质谱（ matrix assisted laser desorption ionization / time of flight MS， MS） 技术对 50 例病理确诊的早期乳腺癌患者和 50 例正常对照人群进行血清蛋白组分析 。 采用 Clin Pro Tools 软件进行蛋白多肽的组间差异对比 。 结果： 在分子量范围 1000 － 10000Da 共检测到 78 个蛋白多肽峰 图， 其中 11 个蛋白多肽峰图具有极显著差异（ P ＜ 0． 001 ） ， 它们中有 5 个蛋白多肽在乳腺癌患者中表达下调， 其余 6 个蛋白多肽在乳腺癌患者中表达上调 。其中， 质核比（ m / z） 为： 4957． 03 以及 4600． 01 ， 在乳腺癌患者 组与正常对照人群血清中为最大差异表达的蛋白多肽 。 结论： 利用液体芯片 － 飞行时间质谱技术以及 Clin Prot 系统可捕获到丰富且稳定的乳腺癌患者血清蛋白多肽图谱并能筛选出多个组间显著差异表达的蛋白多 肽， 可作为乳腺癌临床辅助诊断的潜在疾病标志物 。 【关键词】 液体芯片 － 飞行时间质谱；乳腺癌；血清蛋白组；疾病标志物 【中图分类号】 Ｒ737． 9 【文献标识码】 A DOI：10． 3969 / j． issn． 1672 － 4992． 2014． 09． 24 【文章编号】 1672 － 4992 － （ 2014 ） 09 － 2082 － 04 乳腺癌是女性较常见的恶性肿瘤之一， 全世界每年约有 120 万妇女患病， 50 万人死亡。 在美国及其他西方国家， 乳 腺癌发病率位于女性恶性肿瘤的第一位， 中国虽然是乳腺癌 的相对低发地区， 但随着生活方式的改变， 城市化进程加快， 近年来乳腺癌发病率正逐年增加， 已成为城市中死亡人数增 长较快的癌症之一