五种常用菌-抑菌活性的测定

五种常用菌-抑菌活性的测定

基础材料：

18×180试管200 μL枪头LB固体培养基

打孔器1000 μL枪头LB液体培养基

1000 μL移液枪无菌牙签无菌水

200 μL移液枪无菌平板0.9%生理盐水

涂布棒接种环酒精灯

菌种及培养基：

常用五种菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌

LB固体培养基：10 g胰蛋白胨+5 g酵母浸粉+10 g氯化钠+15 g琼脂粉+1 L蒸馏水

LB液体培养基：10 g胰蛋白胨+5 g酵母浸粉+10 g氯化钠+1 L蒸馏水

实验步骤：

一、准备阶段（材料灭菌）

取洁净锥形瓶，配制LB液体培养基，磁力搅拌器加速溶解，另取洁净锥形瓶，配制LB固体培养基，在LB液体培养基基础上添加琼脂粉即可，锥形瓶需要加塞（棉塞）后用牛皮纸/报纸（4层）包扎。取数支18×180试管，将混匀的LB液体培

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养基分装进试管，每管10 mL，加塞（试管塞），另取数支18×180试管，每管装入9 mL 9%的生理盐水，加塞。准备足量两种型号的枪头，装入枪头盒中用牛皮纸/报纸包扎。准备一瓶无菌水，同样锥形瓶加塞包扎。最后再将足量平板装入平板桶或牛皮纸/报纸包扎。上述物品一同121℃高压灭菌20 min，取出备用。

二、活化细菌

灭菌完毕，瓶中LB固体培养基的琼脂在冷凝后分布不均匀，使用前需要用电热套或电热炉，将LB固体培养基加热至完全融化并沸腾后使用，沸腾后将锥形瓶移走并轻轻摇匀，待气泡消失，继续加热沸腾，累计三次。

超净工作台使用前需要紫外杀菌30min，材料（除菌外）也需要一同进行紫外照射，将沸腾过三次的LB固体培养基冷却至手可握住的温度，用75%酒精喷洒消毒后放入超净台中，并趁热倒入灭菌后的平板里，待平板冷凝后，将保藏的五种菌分别接种（四区划线）于LB固体培养基上，放置于37℃的培养箱中培养。

挑取长势优良的单个菌落，接种至已灭菌的LB液体培养基试管中，震荡均匀，于37℃恒温箱中培养8-12 h，采用比浊法（如大肠杆菌，根据600nm下吸光值判断近似浓度）判断浓度，如果培养过度，可用9%的生理盐水稀释菌悬液浓度至含菌体约1×106 CFU/mL，备用。

三、抑菌活性的测定

将稀释或生长好的菌悬液分别移取100 μL，打入灭菌后的空平板中，并倒入冷却（防止高温杀死细菌）的LB固体培养基（沸腾三次），匀速晃动（左三圈右三圈）平板，使加入的菌液均匀分布，待培养基凝固，用直径8 mm打孔器在培养基上— 2 —

均匀间隔打孔，无菌牙签用于挑取打孔器未能带出的培养基，每个平板可打3-5个孔，每孔移液枪加样20 μL，个数依据待测样品的数目而定，分别是阳性对照（2 mg/mL的抗生素溶液）、阴性对照（无菌水）和自己的样品。

操作完毕，保鲜膜密封平板，放置于恒温箱中37℃条件下，培养12 h后取出，观察并测量抑菌圈的直径，沿孔的不同方向测量2次，取平均值，记录数据，拍照。

注意事项：

①灭菌前，不同规格的锥形瓶装液上限：500 mL锥形瓶→200 mL，250 mL锥形瓶

→100 mL，以此类推。

②固体培养基使用前，需要沸腾三次。目的是融化培养基，并使琼脂分散均匀，有

利于平板的凝固。沸腾时注意，不要离开加热中的培养基，佩戴手套以防烫伤。

③培养基倾倒时，应保证瓶底温度已经降至单手可承受的状态，以避免过热杀死供

试菌和产生水汽，同时也要确保培养基未凝固。

④以防万一，培养基和试管可以额外准备备用组。

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