林业生物技术课件10.转基因植物及其应用
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根癌农杆菌Ti质粒介导的转化过程主要包括： ① 细菌在植物敏感细胞上的吸附 ② 农杆菌中Ti质粒上的Vir区基因被激活 ③ T-DNA切割和T-DNA复合物形成 ④ T-DNA复合物由农杆菌进入植物细胞 ⑤ T-DNA以单或多拷贝随机整合到植物基因组并
进行表达。
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
原生质体。外源DNA易导入、基因型一致、适合各 种转化方法、遗传稳定性差、培养技术难度大。 愈伤组织。外源DNA易导入、适合各种转化方法、 可继续扩繁、遗传稳定性差、嵌合体高。 种质系统。外源DNA易导入、可简化或缩短育种纯 化过程、受季节限制。 胚状体。外源DNA易导入、变异小。 直接分化芽。变异小、操作简单周期短、有嵌合体。
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
13
1、植物基因工程载体及其构建
绿色荧光蛋白基因（GFP），来自水母。但野生 型GFP发光较弱，甚至在某些植物中不表达，为 适应在植物研究中的应用，已有许多改造的gfp 可满足研究的需要。
冠瘿碱合成酶基因。nos和ocs存在于农杆菌TDNA上，因其启动子是真核型，在农杆菌中不表 达， 故通过检测转化体中冠瘿碱的存在可确定 外源基因的表达。
RB
Vir区
在植物基因转化上应用最多的是根癌农杆菌Ti质粒
冠瘿碱 合成基因
LB
冠瘿碱 代谢基因
复制起始区
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
5
1、植物基因工程载体及其构建
T-DNA区。是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，该 DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。
多次筛选培养
生根培养
转基因植株
外源基因组织化学检测、 分子检测
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
15
2、植物遗转化方法和技术
2.2 直接转化
采用基因枪法获得转基因植物
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
16
2、植物遗转化方法和技术
PEG(聚乙二醇)法，细胞融合剂，是外源DNA形成 可被植物原生质体主动吸收的DNA沉淀。 电激法，利用高压电脉冲作用，使原生质膜的结 构改变并形成可逆性的开闭通道，从而使原生质 体易吸收外源DNA。 显微注射转化法，利用显微注射仪将外源DNA直 接注入受体细胞的细胞核或细胞质中。 其他转化方法，超声波、脂质体等
11
1、植物基因工程载体及其构建
1.5 植物遗传转化中常用的选择标记基因及报告基因
1.5 .1选择标记
磷酸新霉素转移酶基因（nptⅡ）。由它编码的 产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶对某些氨基葡萄糖 苷类抗生素如卡那霉素、庆大霉素等有抗性。
潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）。通过酶促磷酸 化作用使潮霉素发生磷酸化而失活，因此在含潮 霉素B的培养基中，含有该标记基因的植株能存 活，不含则死亡。
花青素合成有关的基因。
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14
2、植物遗转化方法和技术
2.1 载体转化
植物受体材料 （植物细胞、组织、器官等）
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
含植物转化载体的农杆菌菌液
浸染（10-20min） 共培养（2-4h）
田间试验、遗传分析、形状鉴定
选择诱导分化 （培养基+选择压+抑菌剂，约4周）
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4
1、植物基因工程载体及其构建
1.3 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
根癌农杆菌，含有Ti质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 形成肿瘤，即诱发冠瘿碱
T-DNA区
细胞分类素 合成基因
发根农杆菌，含有Ri质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 产生毛发状根
生长素 合成基因
其他选择标记。
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1、植物基因工程载体及其构建
1.5 .2 报告基因
报告基因
Reporter gene，是编码一种易于检测蛋白质 或酶的基因，通过它的瞬时及稳定表达来检测目 的基因是否转化成功，起报告作用。
β-葡萄糖酸酶基因（gus），来自大肠杆菌，在 一定条件下与其底物X-Glucuionic acid作用会 使有GUS活性的细胞染成蓝色。
Vir区。即毒性区，又称致瘤区域，其长度约 35kb。
Con区。该区段上存在着与细菌间接合转移的有 关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
Ori区。该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故 称为复制起始区。
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6
1、植物基因工程载体及其构建
1.4 Ti质粒基因转化的原理
激活诱导其他基因表达
T-DNA进入染色体
在VirD2、 VirD4和VirB作用下
T-DNA单链与VirD2结合 VirD1、 VirD2协助
T-DNA单链释放
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10
1、植物基因工程载体及其构建
1.5 Ti质粒的改造与载体构建
双元载体
多克隆 位点
中wenku.baidu.com林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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17
2、植物遗转化方法和技术
2.3 种质系统介导转化
借助植物自身的生殖系统以及细胞结构 实现转化，转化受体细胞通常是受精卵、 子房、花粉粒、幼穗或种胚等 主要方法有花粉管通道、生殖细胞浸泡 法和子房注射法等
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1、植物基因工程载体及其构建
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
8
1、植物基因工程载体及其构建
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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1、植物基因工程载体及其构建 植物细胞受伤
产生酚类物质 （乙酰丁香酮）
激活根癌农杆菌 受体virA 信号传递
激活virG 诱导表达
1
植物基因工程载体及其构建
2
植物遗转化方法和技术
3
转化体的筛选与检测
4
应用基因工程改良植物性状
5
转基因植物的环境释放及生物安全性问题
1
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1、植物基因工程载体及其构建
1.2 植物基因工程受体系统
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进行表达。
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原生质体。外源DNA易导入、基因型一致、适合各 种转化方法、遗传稳定性差、培养技术难度大。 愈伤组织。外源DNA易导入、适合各种转化方法、 可继续扩繁、遗传稳定性差、嵌合体高。 种质系统。外源DNA易导入、可简化或缩短育种纯 化过程、受季节限制。 胚状体。外源DNA易导入、变异小。 直接分化芽。变异小、操作简单周期短、有嵌合体。
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1、植物基因工程载体及其构建
绿色荧光蛋白基因（GFP），来自水母。但野生 型GFP发光较弱，甚至在某些植物中不表达，为 适应在植物研究中的应用，已有许多改造的gfp 可满足研究的需要。
冠瘿碱合成酶基因。nos和ocs存在于农杆菌TDNA上，因其启动子是真核型，在农杆菌中不表 达， 故通过检测转化体中冠瘿碱的存在可确定 外源基因的表达。
RB
Vir区
在植物基因转化上应用最多的是根癌农杆菌Ti质粒
冠瘿碱 合成基因
LB
冠瘿碱 代谢基因
复制起始区
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1、植物基因工程载体及其构建
T-DNA区。是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒 上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，该 DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。
多次筛选培养
生根培养
转基因植株
外源基因组织化学检测、 分子检测
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2、植物遗转化方法和技术
2.2 直接转化
采用基因枪法获得转基因植物
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2、植物遗转化方法和技术
PEG(聚乙二醇)法，细胞融合剂，是外源DNA形成 可被植物原生质体主动吸收的DNA沉淀。 电激法，利用高压电脉冲作用，使原生质膜的结 构改变并形成可逆性的开闭通道，从而使原生质 体易吸收外源DNA。 显微注射转化法，利用显微注射仪将外源DNA直 接注入受体细胞的细胞核或细胞质中。 其他转化方法，超声波、脂质体等
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1、植物基因工程载体及其构建
1.5 植物遗传转化中常用的选择标记基因及报告基因
1.5 .1选择标记
磷酸新霉素转移酶基因（nptⅡ）。由它编码的 产物氨基葡萄糖苷磷酸转移酶对某些氨基葡萄糖 苷类抗生素如卡那霉素、庆大霉素等有抗性。
潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）。通过酶促磷酸 化作用使潮霉素发生磷酸化而失活，因此在含潮 霉素B的培养基中，含有该标记基因的植株能存 活，不含则死亡。
花青素合成有关的基因。
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2、植物遗转化方法和技术
2.1 载体转化
植物受体材料 （植物细胞、组织、器官等）
根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
含植物转化载体的农杆菌菌液
浸染（10-20min） 共培养（2-4h）
田间试验、遗传分析、形状鉴定
选择诱导分化 （培养基+选择压+抑菌剂，约4周）
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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1、植物基因工程载体及其构建
1.3 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
根癌农杆菌，含有Ti质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 形成肿瘤，即诱发冠瘿碱
T-DNA区
细胞分类素 合成基因
发根农杆菌，含有Ri质粒， 能诱导被侵染的植物细胞 产生毛发状根
生长素 合成基因
其他选择标记。
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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1、植物基因工程载体及其构建
1.5 .2 报告基因
报告基因
Reporter gene，是编码一种易于检测蛋白质 或酶的基因，通过它的瞬时及稳定表达来检测目 的基因是否转化成功，起报告作用。
β-葡萄糖酸酶基因（gus），来自大肠杆菌，在 一定条件下与其底物X-Glucuionic acid作用会 使有GUS活性的细胞染成蓝色。
Vir区。即毒性区，又称致瘤区域，其长度约 35kb。
Con区。该区段上存在着与细菌间接合转移的有 关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。
Ori区。该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故 称为复制起始区。
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1、植物基因工程载体及其构建
1.4 Ti质粒基因转化的原理
激活诱导其他基因表达
T-DNA进入染色体
在VirD2、 VirD4和VirB作用下
T-DNA单链与VirD2结合 VirD1、 VirD2协助
T-DNA单链释放
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1、植物基因工程载体及其构建
1.5 Ti质粒的改造与载体构建
双元载体
多克隆 位点
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2、植物遗转化方法和技术
2.3 种质系统介导转化
借助植物自身的生殖系统以及细胞结构 实现转化，转化受体细胞通常是受精卵、 子房、花粉粒、幼穗或种胚等 主要方法有花粉管通道、生殖细胞浸泡 法和子房注射法等
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1、植物基因工程载体及其构建
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1、植物基因工程载体及其构建
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1、植物基因工程载体及其构建 植物细胞受伤
产生酚类物质 （乙酰丁香酮）
激活根癌农杆菌 受体virA 信号传递
激活virG 诱导表达
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植物基因工程载体及其构建
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植物遗转化方法和技术
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转化体的筛选与检测
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应用基因工程改良植物性状
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转基因植物的环境释放及生物安全性问题
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1.2 植物基因工程受体系统
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