多维色谱技术

占80%，色谱条件优化过程可参考普通一维GC。
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全二维气相色谱技术
全二维气相色谱的特点
① 为保证第一维馏分的色谱峰形在调制过程中不宽展，调 制周期（Modulation Criterion）不得大于第一维色谱 峰宽的1/4，一般为5-30s。 ② 为防止色谱峰重叠，第二维分析时间一般控制在2-8s。 以防止发生峰重叠（Wrap-around）。
M. S. Tswett(茨维特)
1903 – Mikhail Tswett defines the Science of Chromatography
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色谱理论回顾
有效塔板数和有效塔板高度
• 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。
• 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。
• 组分在 tM 时间内不参与柱内分配。需引入有效塔
浓 缩 和 酶 解
质 谱百度文库鉴 定
第一维
色谱聚焦原理
A
首先利用 pH=8.5的起始缓冲液进 行平衡。蛋白质1（pI = 9.5）的分 子被柱子排斥，并且在pH=8.5 时 洗脱。蛋白质2（pI = 6.0）的分子 在该 pH 值下吸附到柱上。 将 pH=4.0的洗脱缓冲液加到柱上， 并且在柱中形成pH梯度。当pH 值 与pI 值相等时，蛋白质2的分子即 发生解离。分子在柱中不断前进， 并且在pH 值高于pI 值时进行结合。
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全二维气相色谱应用 手性化合物的分离
Enantio-GC x GC-FID of tea tree essential oil. J. Sep. Sci. 2001,24:823
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全二维气相色谱应用
柴油的GC× GC–FID色谱图
非极性×极性
极性×中等极性
也可获得有序结构
J. Chromatogr. A. 2004(1054):47
侯晓芳 houxiaofang@mail.xjtu.edu.cn
主要内容
一、色谱理论回顾 二、二维液相色谱技术
三、二维气相色谱技术
四、其它多维色谱技术 五、细胞膜色谱技术
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主要内容
一、色谱理论回顾 二、二维液相色谱技术
三、二维气相色谱技术
四、其它多维色谱技术 五、细胞膜色谱技术
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色谱技术起源
Chromatography Inventor
→尽管组分的峰分布是有序的,但多维系统的 高峰容量的性能并没有得到发挥。 只有当这两个维数相等时,才能充 分发挥多维系统的分离能力。
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在线二维液相色谱
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全 2DLC阀切换原理
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全 2DLC阀切换原理
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全 2DLC研究路线
Shot gun 技术
Trypsin 酶解
样品(细胞、组织等)
多肽混合物
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二维液相色谱
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二维液相色谱仪器
美国戴安U3000 美国热电
日本岛津nano2DLC
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离线二维液相色谱
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离线二维液相色谱
Bottom up技术
研究整体蛋白质组
待 检 测 蛋 白 质 混 合 物 非 多 孔 填 料 的 反 相 柱
第二维
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根据不同蛋白质的等 电点不同进行分离
色谱聚焦
收 集 馏 分
品的全成分分析，省去了多次分析和重建谱图的麻烦。
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全二维气相色谱技术 常规正交分离模式的仪器配置
第一维 Length 15-30m × ID 0.25-0.32mm × Film 0.1-1μm （非极性固定相，按沸点差异分离）
调制器
第二维 Length 0.5-2m × ID 0.1mm × Film 0.1μm （其他类型固定相，按特定机理分离）
J. Chromatogr. A. 2005,1086:29
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全二维气相色谱应用 天然产物分析
GC× GC–FID chromatogram of roasted Arabica coffee beans using a SupelcoWax-10×SPB-5 column.
J. Sep. Sci. 2004,27: 442
正交性 最好！
immobilized liposome chromatography（ILC）
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Anal Chim Acta, 2012, 713: 121-129
主要内容
一、色谱理论回顾 二、二维液相色谱技术
三、二维气相色谱技术
四、其它多维色谱技术 五、细胞膜色谱技术
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传统气相色谱
传统气相色谱的不足：
用时： 60min.
OV-1 × OV-1701 极性
t1(min)
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全二维气相色谱应用
GC× GC分离检测环境中的29种有害物
DB-XLB × 007-65HT 极性
DB-XLB × VF-23 极性
DB-XLB × LC-50 极性
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全二维气相色谱应用 农药分析
GC× GC-ECD chromatogram on DB-1× 007-65HT of PCAs (PCA-60), PCTs (Aroclors 5442 + 5460) and technical toxaphene.
Cs u
1 k
qk ' d 2 fu
' 2
Ds
流动相传质
dp: 粒度
固体固定相传质
Cs u
1 k
2td k 'u
CM u
2 f d p ,d c2 u
' 2
DM
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色谱理论回顾
Giddings理论：
n VR N 峰容量 n 1 4 ln V 1 R
V R1
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全二维液相色谱理论 2.分离模式
① 正相色谱法 × 反相色谱法 （ NP×RP） ② 离子交换色谱法× 反相色谱法 （ IC×RP） ③ 反相色谱法 × 反相色谱法 （ RP×RP） ④ 体积排阻色谱法 × 反相色谱法 （ SEC×RP） ⑤ 体积排阻色谱法× 正相色谱法 （ SEC×RP）
3.影响因素
③ 由于第二维分析速度快，故要求检测器的扫描速率不得 小于100Hz（ECD、FID、TOF）。 ④ 为了配合调制周期，第一维分析的升温速率一般最高为 2-3℃/min。
⑤ 第二柱很短，涂渍液很薄。化合物峰宽在100-200ms。 ⑥ 一般不为第二维色谱柱单独设柱温箱。
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全二维气相色谱技术
调制（Modulation）
① 接口 ② 流动相种类、浓度、梯度比例 ③ 阀切换时间 ④ 连接管内径和长度等
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全二维液相色谱理论
Giddings 理论
多维色谱的总峰容量(P)等于每一维的峰容 量(Pi)的乘积。 P=P1×P2×P3 · · · · · ·
假如两种分离系统都有100的峰容量,那么良 好的二维系统理论上可产生10000的峰容量。
与一维分离模式相比,多维分离技术的最大 特点是可极大地提高峰容量。
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全二维液相色谱理论
Giddings指出峰容量的提高程度和样品组分分布 的有序程度有着密切的关系。
样品维数(sample dimensionality)
样品维数大于系统维数：
→组分的峰分布是无序的,会限制分离的效果。
样品维数小于系统维数：
PI=9.5 PI=6.0
B
C
D
洗脱缓冲液和 pH梯度展开液继续 流动。蛋白质 2的分子继续沿着柱 子解离和结合。
E
当柱子流出液的pH 值为6.0 时，所 有的蛋白质 2将从柱上解离并洗脱 下来。
离线二维液相色谱
色谱聚焦
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应用
pH梯度 11.3 pH 8.85–8.74
8.3
白色念珠菌感染\未感染巨噬细胞
峰容量
V Rn
V R1 V Rn
第一个和最后一个色谱峰保留体积
当样品组分数多于峰容量数，将不可避免出现重叠峰！
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色谱理论回顾
柱内径对灵敏度的影响
不同方法的柱效和峰容量
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问题的提出
样品复杂性
一维色谱峰容量的局限性
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主要内容
一、色谱理论回顾 二、二维液相色谱技术
三、二维气相色谱技术
四、其它多维色谱技术 五、细胞膜色谱技术
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全二维气相色谱技术
调制器（Modulator）的类型
J. Chromatogr. A, 2003,69:1000.
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全二维气相色谱技术
GC柱箱内部，显示的是GC× GC组件和连接。 A. B. C. D. 进样口 第一维色谱柱 连接器 四喷口调制器 E. 第二维柱箱 F. 接口 G. 检测器
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全二维气相色谱技术 全二维气相色谱仪结构示意
modulator
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J. HRC &CC,1999,22:235
全二维气相色谱技术 1. 正交性 (Orthogonality) 理论上两维色谱柱固定相的保留机理差别越大则峰 容量越大，正交性越好，色谱峰分布越稀疏，图谱有效 面积越大。否则色谱峰将分布与对角线附近。 2. 有序结构 (Ordered Structure) 被分离组分按化合物结构类型分片分布，异构体或 结构相似的同系物按顺序排列，可以实现族分离。色谱 峰分布清晰，简化了色谱峰的解析和谱图的重建。 3. 快速全成分分析 在分离度和灵敏度相同的前提下可一次完成复杂样
选择性
保留因子
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
1.0
1.25
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色谱理论回顾
速率理论
H = A + B/u + C· u
涡流扩散项
A = 2λdp
采用小粒径的固定相填料，均匀填装柱子。
B = 2 γDM
分子扩散项
气相色谱
采用内径小的柱子，如毛细管柱。
C =（Cm + Cs） 传质阻力项
载体采用薄液膜或小颗粒。 df: 薄膜厚度 液体固定相传质
进样
阳离子色谱柱(第一维色谱)
RP-HPLC(第二维色谱) MS ,MS/ MS (多肽序列分析)
蛋白质数据库检索
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应用于中药分离研究 分离鉴定桔梗提取物中的苷类化合物
一维： C18柱
(150 mm × 1 mm I.D. 5 μm) 乙腈 :水梯度洗脱 , 50 μL/min
二维： NH2柱、CN柱
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全二维气相色谱应用 柴油的 GC× GC色谱分离
t2(min)
获得大约 2000个峰 第 1维 : 1m× 0.1mm× 3.0μm OV-1, 调制毛细管 : 0.1m× 0.1mm× 3.0μm 007-1, 第 2维 : 1.0m× 0.1mm× 0.1μm OV-1701.
柱温 : 35℃ (5min)-5℃ /min-250℃ .
板数和有效塔板高度：
tR 2 tR 2 n 5.54( ) 16( ) Y1/ 2 Wb
n有效
' ' tR t 5.54( ) 2 16( R ) 2 Y1/ 2 Wb
H 有效
L n有效
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色谱理论回顾
分离度
α N 选择合适的固定相，流动相及柱温 N=L/H 增加柱长，减小板高
系统性能
(50 mm × 3 mm I.D., 3 μm) 乙腈 :水等度洗脱 , 1.0 mL/min
30℃ , 每 1.5 min切换 , 质谱检测
J Chromatogr A, 2010, 1217 (26): 4375
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应用于中药分离研究
氰基×整体柱
苯基柱×整体柱
C8×整体柱
ILC×整体柱
相关性 最好！
调制的作用：
1. 切割一维馏分 2. 进行一维馏分重聚焦 3. 以脉冲形式将一维馏分送入二维
J. Chromatogr. A, 2003,69:1000.
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全二维气相色谱技术
调制器（Modulator）的类型
热调制器
通过移动加热来聚焦分析物（即热扫帚方式） 另一种是通过冷阱方式对分析物进行柱内捕集和聚焦 阀调制器 通过一个六通阀收集第一柱流出的馏分并周期性地将其 注射进第二柱。80 %的第一柱流出物被注射进第二柱并到 达检测器，因而具有较高的灵敏度。
色谱聚焦×反相色谱
白色念珠菌蛋白图谱
Proteomics 2006, 6(4): 1143-1150.
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二维液相色谱
中心分割二维液相色谱
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二维液相色谱
全二维液相色谱
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二维液相色谱
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全二维液相色谱理论
1. 全二维色谱的特征
样品的每一部分都受到不同模式的分离 所有样品组分以相等的比例转移到二维 第二维的分离速度要足够快
1. 即使采用毛细管色谱柱，传统一 维 GC的峰容量仍然有限。 2. 采用中心切割法的普通二维GC 难以从复杂体系中对目标组分进 行筛选。 3. 重建谱图困难。
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全二维气相色谱技术
全二维气相色谱
创始人：John B. Phillips 时间：1991 文献：Z.Y. Liu, J.B. Phillips. Comprehensive Two-dimensional Gas Chromatography using an On-Column Thermal Modulator Interface. Journal of Chromatogrophic Science. 1991,29:227