第九章吸光光度法(简)

曲线都相似。
(cKMnO4:a<b<c<d)
苯 (254nm) A
甲苯 (262nm)
230
250
270

苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱 形状及max均不同
吸收光谱或吸收曲线
max
定性分析基础 不同的物质，其吸收曲线 形状和最大吸收波长各不相同， 可对物质进行定性分析。 定量分析基础 不同浓度的同一物质，其
测组分掩蔽后再加显色剂,以此溶液作参比溶液.
max不变，在吸收峰及附近处
，吸光度随浓度增大而增大，
KMnO4溶液的吸收曲线
呈一定比例关系。可对物质进 行定量分析。
(cKMnO4:a<b<c<d)
吸收曲线说明 (1)物质呈现颜色是由于对光的选择性吸收 (2)是选择测定波长的重要依据（λmax）
(3)物质一定时，随浓度增大，吸光度也增大，
但最大吸收波长λmax不变。
吸收曲线: 将不同波长的光通
0.4
max
III I 0.0002mg/mL II 0.0004mg/mL III 0.0006mg/mL
过某一固定浓度和厚度 的有色溶液,测量每一波 长下的吸光度 横坐标：波长λ
纵坐标：吸光度A 作图,即可得一曲线.这 种曲线描述了物质对不 同波长光的吸收能力,称 吸收曲线。
（待测组分） （显色剂）
为了保障反应完全，且对反应无不利影响，需
通过实验确定合适的显色剂用量．
确定方法：将待测组分的浓度c及其他条件固定，
加入不同量的显色剂，测定其吸光度绘制吸光度
A――浓度CR关系曲线，得到三种曲线.
2.反应体系的酸度
在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下
显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的
平坦区所对应的pH范围。 3.显色时间与温度
实验确定
4.溶剂 5.干扰的消除
三 显色剂
1 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。 2 有机显色剂：种类繁多 （1）偶氮类显色剂：性质稳定、显色灵敏度高、选择 性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。 （2）三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
§9－4 吸光度测量条件的选择
朗伯—比尔定律是建立在
均匀、非散射的溶液这个基础
上的。如果介质不均匀，呈胶 体、乳浊、悬浮状态，则入射 光除了被吸收外，还会有反射 、散射的损失，因而实际测得
的吸光度增大，导致对朗伯—
比尔定律的偏离。Baidu Nhomakorabea
3. 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化 其中有色化合物的离解是偏离朗伯—比尔定律的主
要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色 配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡： Fe(SCN)3 Fe3+ + 3SCN－ 溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当 溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一 半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯 —比尔
20
30
40 透光率 T%
50
60
70
80
90
100
吸光度与透光率的关系
例9-1 浓度为25.0 μg / 50mL的Cu2+溶液， 用双环已酮草酰二腙分光光度法测定，于 波长600nm处，用2.0cm比色皿测得 T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数 。 已知M(Cu)=64.0。
解 已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，b=2.0cm,
一 选择适当的入射波长
一般应该选择λmax为入射光波长▲
如果λmax处有共存组分干扰时，则应
考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入 射光波长。 如图选 500nm 波长测定，灵敏度虽有 所下降，却消除了干扰，提高了测定的
准确度和选择性。
二 参比溶液的选择
I 参比 I0 A lg lg I I 试液
分光光度计
分光光度计
四 光度计的基本部件
光源
单色器 样品室 检测器 显示器
§9－3 显色反应与条件的选择
一、显色反应的选择 显色剂▲
无色 有色
待测物在某种试剂的作用下，转变成有色化合物 的反应叫显色反应，所加入试剂称为显色剂。 常见的显色反应大多数是生成配合物的反应， 少数是氧化还原反应和增加吸光能力的生化反应。
1.单色光不纯所引起的偏离
朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成 立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计 所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度
。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关
系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入
射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离
越小。
2.由于溶液本身的原因所引起的偏离
第九章
吸光光度法
Chapter 9 Spectrophotometry
根据试样颜色深浅的程度与已知标准溶液比 较来确定物质含量的方法称为比色法。 用分光光度计进行比色分析的方法称为吸光/ 分光光度法。
吸光/分光光度法 是基于物质分子对光的选择性吸 收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不 同，可分为比色法、可见分光光度法、紫外分光光 度法及红外分光光度法。
对显色反应的要求
1 灵敏度高，即ε要大，一般为104～105。
2 选择性好，最好仅与一种或少数几种显色。
3 显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大
吸收波长之差：“对比度”，要求△ > 60 nm。 4 化学性质稳定。
二、显色反应条件的选择
1 显色剂用量
显色反应 ▲
M +
R
MR
（有色化合物）
重量法： m(Fe2O3)≈0.14mg, 称不准 容量法： V(K2Cr2O7 ,浓度1.6x10-3mol/L)≈0.02mL, 测不准
光度法 ： 结果0.048%～0.052%, 满足要求
分光光度法的特点： 1 灵敏度高。检测下限可达10－5～10－6 mol/L，适用于微量分析； 2 比色法相对误差5～10％； 分光光度法相对误差2～5％ （满足微量要求） 3 操作简便、检测快速； 4 应用广泛，几乎所有无机物和多数有机物均 可检测。
§9－1 吸光光度法的基本原理
一 物质对光的选择性吸收
界面反射损失
吸收后
溶液中 透射光束
I0
入射光束
散射损失
I
界面反射损失
溶液对光的作用示意图
物质对光的选择性吸收的原因
• 分子、原子、离子具有不连续的量子化能级 当照射光子的能量hv与被照射粒子的基态和激发 态的能级差 ΔE=E激 － E基 ＝ hv =hc/λ 相等时才能发生吸收。 • 不同物质微粒的结构不同，量子化能级的能量差 ΔE也不同， 则λ 也不同，因此物质对光的吸收具 有选择性 • 选择性：不同物质对特定波长的光具有最大吸收。
0.3
A
0.2
II
I
0.1
0.0 400
500
600
/nm
１，１０－邻二氮杂菲亚 铁溶液的吸收曲线
吸收光谱或吸收曲线
max
KMnO4溶液
对波长525nm附近的绿
色光吸收最强，而对紫
色光吸收最弱。光吸收 程度最大处的波长叫做 最大吸收波长，用max 表示▲。不同浓度的
KMnO4溶液所得的吸收
KMnO4溶液的吸收曲线
化学分析与光度分析方法比较
化学分析：常量组分(>1%),相对误差 0.1%～0.2% 准确度高 依据化学反应, 使用玻璃仪器
光度分析：微量组分(10-3～10-6), 相对误差2%～5% 灵敏度高 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器 例: 含Fe约0.05%的样品, 称0.2g, 则 m(Fe)≈0.1mg
朗伯—比尔定律的另一数学表达式 ▲
I0 A lg bc I
式中ε：摩尔吸收系数 ，单位 L· mol-１· cm-１； b：液层厚度，以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位 mol· L-１；
a 与ε 的关系为：
ε= M a （M为摩尔质量）
摩尔吸收系数 的含义 当c的单位用mol· L-1表示时 A＝ bc 的单位: L· mol -1· cm -1
定律。
§9－2 目视比色法及光度计的基本部件 一 目视比色法
用眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量 的方法称为目视比色法。
二 光度分析法
1 光电比色计－光电比色法－滤光片 2 分光光度计－分光光度法－棱镜或光栅 （单色器）
三 光度法与目视法比较的优点：
1 准确度高。消除了人眼睛的主观误差。 2 选择性强。可利用单色器消除干扰。 3 使用标准曲线可简化手续加快分析速度。
光学光谱区
远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外 远红外
（真空紫外）
10nm~200nm
200nm ~380nm
380nm ~ 780nm
780 nm ~ 2.5 m
2.5 m ~ 50 m
50 m ~300 m
物质的颜色与光的关系
•单色光: 只具有一种波长的光。 •混合光: 由两种以上波长组成的光。 •白光: 由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种
单色光按一定比例混合而成。
光的互补:两种不同颜色的单色光按一定的 强度比例混合得到白光，称这两种单色光为互 补色光，这种现象称为光的互补。
绿
蓝绿
黄绿
黄 橙
绿蓝 蓝 紫 紫红
红
4
光的互补性与物质的颜色
物质的颜色:物质对不同波长 的光具有选择性吸收作用。 吸收光在可见光区,吸收 光与透过光的颜色为互补关系, 物质呈现透过光的颜色。 CuSO4溶液：吸收白光中的 黄色光而呈蓝色； KMnO4溶液：吸收白光中的 绿色光而呈紫色。 如吸收光在紫外区，则物 质不呈现颜色。
0.44
样品
b b
光源
检测器
样品
样品
2.比尔定律：A=k”c
吸光度
光源
0.00
检测器 吸光度
0.22
b
1倍浓度
光源
检测器 吸光度
0.44
b
2倍浓度
光源
检测器
光吸收定律——朗伯—比尔定律的数学表达式 ▲
I0 A lg a b c I
式中 A：吸光度（无量纲单位） I0: 入射光强度 I: 透射光强度 a：吸收系数，单位 L· g-１· cm-１ b: 液层厚度，单位通常为 cm c：溶液的浓度，单位 g· L-１
参比溶液: 在吸光度测定时用来调节仪器的零点,消除由
于比色皿、溶剂、试剂、其它组分对于入射光的
反射和吸收所带来的误差。
原则：
试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。
参比溶液的选择原则
(1)如果仅待测物与显色剂的反应产物有吸收,可用纯
溶剂作参比溶液. (2)如果显色剂或其它试剂略有吸收,应用空白溶液 (不加试样溶液)作参比溶液． (3)如试样中其他组分有吸收,但不与显色剂反应,则 当显色剂无吸收时,可用试样溶液作参比溶液,当显 色剂略有吸收时,可在试液中加入适当掩蔽剂将待
在数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在
厚度为1cm光程中的吸光度A，是物质吸光 能力大小的量度。
值越大，测定方法越灵敏。
通常在104以上时，认为方法灵敏，准确。
透光度T （百分透光度 T %)
描述入射光透过溶液的程度
T = I / I0
吸光度A与透光度T 的关系:▲
I0 A lgT lg b c I
例9-2 某有色溶液，当用1cm比色皿时，其透光度为
T，若改用2cm比色皿，则透光度应为多少？
解: 由A= - lgT=abc可得
T=10-abc 当b1=1cm时，T1=10-ac=T
当b2=2cm时，T2=10-2ac=T 2
三 偏离朗伯――比尔定律的原因
实验中，工作曲线经常偏离线性而弯曲。 偏离原因 （１）非单色光引起 （２）溶液因素引起 （ 3）化学因素引起
(1) 朗伯-比尔定律是吸光光度法的理论基础和定量测 定的依据。 (2) 吸光度具有加和性。
A总 A1 A2 An 1bc1 2bc2 nbcn
吸光度 A 2 1.5 1.0 0.80.7 0.6 0.5 0.9 0.4 0.3 0.2 0.1 0
0
10
二 光吸收基本定律
—— 朗伯―比尔（Larnbert-Beer）定律
三、光的吸收定律—朗伯-比尔定律
1.朗伯定律（1760年） 吸光度A与液层厚度b的关系
2.比尔定律（1852年） 吸光度A与物质浓度c的关系
1.朗伯定律： A = k'b
吸光度
光源
0.00
检测器
吸光度
光源
0.22
b
检测器
吸光度
25.0 106 g 4 1 c 5 . 00 10 （ g L ) 3 50.0 10 L
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
A 0.300 2 -1 1 a 3.00 10 L.g . cm bc 2.0cm 5.00104 g L1
而ε= Ma = 64.0g· mol-1×3.00×102 L· g-1· cm-1 =1.92×104(L· mol-1· cm-1)