HPLC测定有关物质和含量方法验证

HPLC测定有尖物质和含量方法验证

1・有关物质（适用于API ,制剂，也适用于起始物料，中间体）

有关物质方法验证的前提条件：

1. 各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离

2. 根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。多波长检测（如有）则分别考察。

3. 在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N ,预估主成分浓度

4. 各杂质纯度已知

5. 根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度

6. 供试品溶解方法和提取方法得到合理证明

1.1专属性：

1.1.1概念在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。

1.1.2试验方法

1.1.

2.1定位试验：

A.目的

对各已知杂质和主峰进行定位

a. 配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0. 1mg/ml ）的各已知杂质溶液' 拟检测浓度的主成分作为定位溶液

b.配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶

液

c.使用拟定分析方法分别进行定位。

C.试验要求：

a.空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于

1.5 ；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点

b .定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定

c.分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0 （至少1.5 ）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5 （至少1.2 ）；

1.1.

2.2强制降解试验

A. 目的

一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。

对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱' 氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。试验一般的范围为：

强酸：0.T5. Omol/L HCI溶液或视情况调节时间，温度，体积强碱：

0.T5. Omol/L NaOH溶液或视情况调节时间，温度，体积

强氧化剂：30%的H 20 2或视情况配制不同浓度的溶液或视情况调节时间，温度

高温：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验光照：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验

C.试验要求

a. 一般样品含量控制在85% — 90%范围（归一化法），不一定要求每个条件都能降解出来。

b. 在进行酸、碱' 强氧化破坏试验时，每个试验最好都要做相应的空白（溶

剂，空白辅料，复方制剂还包括除去某一主药的其他组分）破坏试验作为辅助。

c. 主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0 （至少1.5 ）,已知杂质与相邻杂质分离度大于1.2

d. 物料守恒，即未破坏主药的C/A与破坏后的C/A值相比，结果在0.9H.1 之间

e. 关于破坏试验，更多内容请参阅lyslinjiu版主在帖子【讨论】2013-专属性实验（强制降解试验）2013-专属性实验（强制降解试验）- 丁香园论坛

f. 在此处做梯度时间（如有）延长验证试验。即将分析方法的梯度中，有机相

比例最大的时长延长（建议延长时间为主峰保留时间或10~20min ）,考察是否降解出难以洗脱的物质在拟定方法的梯度周期内能有效检出。进一步考察分析方法的合理性

1.2定量限 1.

2.1概念样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。

A. 目的考察杂质的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理

B. 试验方法

配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。

C. 试验要求

定量限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/5

1.3检测限

1.3.1概念

样品中能被检测出的最低量，仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。

1.3.2验证方法

A. 目的考察杂质的最低检出量，同时评判供试品浓度的选择是否合理

B. 试验方法

配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为3时，得检测限。

C. 试验要求

检测限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/10

1.4溶液稳定性

1.4.1目的

考察被测各溶液在特定时间周期内的稳定性1.4.1目的

a. 配制系统适应性溶液、供试品溶液、对照品溶液，在室温条件下，分别在各时间点进样

b. 如不稳定，需考察在低温条件下的溶液稳定性

c. 时间范围根据试验需要来确定。比如做回收率中需要至少连续测定9份供试品，是所有单个验证项目中最长的，选择这个时间点是可以的。也有考虑到以后需要测定更多的样品，选择更长的时间范围。

1.4.3试验要求

a. 系统适应性溶液，各峰之间分离度应符合要求。

b. 对照品溶液峰面积RSD应小于2.0%

c. 供试品溶液，杂质个数和杂质量应一致，峰面积RSD应小于5. 0% ；不得检出新增杂质

d. 如不稳定，需临用现配或低温保存

1.5仪器精密度

1.5.1概念

同一溶液，连续进样6次，其tR和峰面积的精密度，考察仪器的进样精密度

1.5.2试验方法

配制限度浓度的各杂质和主成分的混合溶液，连续进样6次