CMV、PVY 、TMV、3种植物病毒ELISA检测实验步骤

CMV、PVY 、TMV、3种植物病毒ELISA检测实验步骤以下斜体部分均为1块96孔ELISA板试剂用量
1.磨样：在2mL离心管中加如10粒钢珠后，加入0.25-0.30g叶片（1.5cm打孔器9
片叶子的重量），再加入800μL抽提缓冲液（1*GEB）。

样品经组织研磨器磨碎处理后，1200转离心2min，将上清液转入新的离心管，编号后4℃保存，作为待测样本。

2．稀释包被抗体：10mL包被缓冲液+50μL包被抗体浓缩液；
(一般下午或晚上做2，3，4步骤)
3.包被ELISA板：（用排枪加样）每孔加入100μL上述包被抗体稀释液；
4孵育：加样完成后，将ELISA板放入冰箱冷藏室，4℃过夜。

5.洗板：
(1).将包被好的ELISA板废液倒掉,在吸水纸上拍干；
(2).每孔加入1*PBST,静置1min，倒掉并拍干。

连续洗3次，拍干。

6.加待测样本：（用单道枪加样，每加一个样换一次枪头）每孔加100μL待测样本，阳性对照孔加100μL阳性对照液（按阳性质控小瓶上说明加适量抽提缓冲液（1*GEB）稀释），阴性对照孔加100μL抽提缓冲液（1*GEB）。

阳性对照和阴性对照均设双孔。

（注意：严格对照实验设计图表仔细加样，不可加错样。

）
7.孵育：加样完成后，将ELISA板放入生化培养箱，25℃放置2h；
8.洗板：同5，重复4次，最后一次洗板结束后，彻底拍干。

（注意：洗板结束前20min，完成第9步制备酶标抗体稀释液。

）
9.制备酶标抗体稀释液：
TMV:10mL ECI缓冲液+50μL TMV酶标记物，混匀（TMV只有一种酶标记物）；CMV:10mL ECI缓冲液+50μL A酶标抗体+50μL B酶标抗体，混匀；
PVY:10mL ECI缓冲液+50μL A酶标抗体+50μL B酶标抗体，混匀。

10.加酶标抗体稀释液：（用排枪加样）每孔加100μL上述相应的酶标抗体稀释液。

11.孵育：加样完成后，将ELISA板放入生化培养箱，25℃放置2h；
12.制备PNPP底物：称取10mg PNP固体粉末，加入10mLPNP缓冲液，使其完全溶解。

(注意：1、PNPP有毒，不可直接接触皮肤；2、PNPP粉末和溶液均不可暴露在强光下。

)
13.洗板：同5，重复6次。

最后一次洗板结束后，彻底拍干，并且确定孔中没有小气泡。

14.加PNP底物:(用排枪加)每孔加入100μL PNP底物；
15.显色：加样完成后，将ELISA板放入生化培养箱，25℃放置1h；
(注意：孵育显色时，ELISA板避免光线照射。

)
16.读数：将显色后的ELISA板置于酶标仪中，405nm条件下读数；
(注意：只有在阳性质控孔明显显色，且阴性对照孔不显色时，实验结果才是可靠的。

)
溶液制备1.包被缓冲液（需2000mL）
2.1*PBST(洗涤液)（需200L）
3.抽提缓冲液（1*GEB）（需5000mL）
4.ECI缓冲液（现配）（需2000mL）
5.PNPP（4-硝基苯基磷酸二钠盐）缓冲液（现配）（需2000mL）
６.1mol/L HCl
7.1mol/L NaOH。