核酸提取原理及方法ppt课件

小鼠gDNA电泳图
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基因组DNA提取常见问题
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA降解 DNA量少
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基因组DNA提取常见问题分 析
DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 ——抽提纯化、高盐洗涤
DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 ——重新沉淀
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质粒DNA提取及检测——实验准备
1.实验器材
台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。
破壁或裂解不充分 ——充分研磨、破壁酶、延长裂解时间
沉淀不完全 ——低温、延长沉淀时间
洗涤使得丢失DNA
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一． 核酸简介 二． 基因组DNA提取 三． 质粒DNA提取 四． 真核细胞总RNA提取 五． 琼脂糖凝胶电泳
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质粒DNA提取
质粒DNA提取的方法： 碱裂解法 煮沸法
提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 注：SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、 细胞、全血、细菌、酵母等。
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基因组DNA提取——SDS 法
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基因组DNA提取——CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH 8.0）
EDTA （pH 8.0）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
0.4 M
3% (W/V)
5% (W/V)
2%（V/V）使 用前加入
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形
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基因组DNA提取——CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
100 mM
EDTA （pH 8.0）
NaCl
20 mM
0.4 M
CTAB 2% (W/V)
β-巯基乙醇
0.1%（V/V） 使用前加入
Tris-HCl （pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
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百度文库
质粒DNA提取——碱裂解法 原理
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离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理
离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的SDS-碱裂解 法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值 状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将 杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗脱 缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具 有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝 数，并表达所携带的遗传信息。
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一． 核酸简介 二． 基因组DNA提取 三． 质粒DNA提取 四． 真核细胞总RNA提取
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基因组DNA提取方法
基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法 SDS法 其他方法
核酸提取原理及方法
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前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的 生物信息分子，是分子生物学研究的主要 对象，因此，核酸的提取是分子生物学实 验技术中最重要、最基本的操作 。
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主要内容
一． 核酸简介 二． 基因组DNA提取 三． 质粒DNA提取 四． 真核细胞总RNA提取 五． 琼脂糖凝胶电泳
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核酸简介
成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中 酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
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基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法实验流程
植物材料
抽提
离心洗涤
液氮研磨
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
核酸沉淀
DNA溶液
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基因组DNA提取——SDS法
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞， 使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包 括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。
DNA主要储存遗传信息。 RNA主要传递遗传信息。
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核酸简介
如何分离DNA？ 如何分离RNA？
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核酸简介——质粒DNA
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小 从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋 状态存在于宿主细胞中。
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基因组DNA提取——CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六 烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细 胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（>0.7 mol/L NaCl）是可溶的， 通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加 入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
SDS提取缓冲液的配方
组份 终浓度
Tris-HCl （pH 8.0）
50 mM
EDTA （pH 8.0 ）
20 mM
NaCl 0.4 M
SDS 2%
Tris-HCl（pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl：提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。
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基因组DNA提取——SDS法
SDS法实验流程（以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
液氮研磨 或匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
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基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶电泳：
以琼脂糖凝胶作为 支持物，利用DNA分子 在泳动时的电荷效应和 分子筛效应，达到分离 混合物的目的。
DNA中残留有金属离子 ——重新70%乙醇漂洗
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基因组DNA提取常见问题分 析
DNA降解
材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA
被机械打断 外源核酸酶污染
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基因组DNA提取常见问题分 析
DNA提取量少
实验材料不佳或量少 —— 选取新鲜（幼嫩）材料