山羊痘病毒属病毒检测技术研究进展

ＡＧ Ｄ 最 早 应 用 于 ６ Ｉ ０年 代 ， 用 于 羊 痘 病 毒 沉 可
中 动 检 ０ 年 ８ 第１ 国 物 疫２ １ 第２卷 ０ １ 期
＇脯
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淀 抗 原 的 检 测 ， 来 利 用 甲硫 氨 酸 对 山 羊 痘 抗 原 进 后 行 标 记 ， 大 地 提 高 了对 山 羊痘 抗 体 的检 测 敏 感 性 。 极 ＡＧＩ 操 作简 单 、 Ｄ 需要 设 备少 、 格便 宜 等特 点而 得 到 价 广 泛 应 用 ， 其 敏 感 性 相 对 较 低 ， 于基 层 兽 医 开 展 但 适
痘 、 羊痘 列为 一类 动物 疫病 ［。 绵 ４ ］ １ 病 原学 检测 技术 １ １ 电镜 观 察 ．
生低 水 平 的 中和 抗 体 ， 因此 该方 法 敏 感 性 不 高 】但 。
水平 的 中和抗 体 。 ２ ２ 荧光 抗体 试验 （ ｕ ｒｓｅ ｔ ｎｉｏ ｙｔｓ Ａ ） ． ｌ ｆ ｏｅｃｎ ｔ ｄ ｔ ａ ｂ ｅ ，Ｆ Ｔ
是， 感染 病 毒后 痊 愈 的动 物 在其 血 清 中 可检 测 到较 高
山 羊痘 病 毒 抗 原可 在 感 染 的组 织 培 养 破 片 上进 的问题 ， 以推广 。 难
ｉ ｍｍｕ ｏ ｉ ｕ ｉｎｔｓ，ＡＧＩ ｎ ｄｆ ｓｏ ｔ ｆ ｅ Ｄ）
行 Ｆ Ｔ来 鉴 定 ， 该 方 法 操作 繁 琐 ， 非特 异 性 反应 Ａ 但 有
ＣａＶ 本 身 不 能 凝 集 红 细 胞 ， Ｐ 因此 利 用 致 敏 的绵
羊红细胞进 行 间接凝集 实验 非常有 用， 如反 向被动 血 凝 试 验 （ｅｅｓｄｐ ｓｉｅｈ ｍａ ｇｕｉａ ｏ ｓａ ， ｒｖ ｒｅ ａｓຫໍສະໝຸດ Baidu ｅ ｇ ｌ ｎ ｔ ｎａｓｙ ｖ ｔ ｉ
砌，Ａ） 要 用 于 临 床 痘 疹 痂 皮 和 感 染 细 胞 中 ＧＰ Ｈ 主 Ｖ
变 ， 整个 细 胞单 层 出现 病变 ， ３ｄ后 特征 为 细胞 膜 收缩
羊 痘病 毒 可作 为 生物 武 器 ， 国疾 病控 制 中心 （ ＤＣ） 美 Ｃ
将 其 划 归 到 Ｉ类 危 险病 毒 。 外 ， 国 、 Ｉ 此 中 印度 、 典 有 瑞 人 感 染羊 痘 病毒 的报 道 ， 因此 羊 痘在 公 共卫 生 方面 也 有 要 意 义 ［。 ３ 牛结 节 疹 于 １ ２ 】 ９ ９年在 赞 比亚 首 次发 生 ， 主 要 分布 在 非 洲 ， 发病 率 ３ ８ ％， 亡 率 差异 很 大 ， ％～ ５ 死
Ｃ Ｐ 是 一种 亲 上 皮 性 的病 毒 ， 畜 的 皮肤 丘 疹 ａＶ 病
和结节、 黏膜 、 血液、 鼻腔分泌物、 肺部病损组织和淋
基金 项 目：国家质检总局科研项 目（ ０９ＫＯ ７ （ ０ ０Ｋ０ ５ ２ ０ Ｉ ２ ）２ １Ｉ １ ） 通讯作 者：李应 国， 刘力
２３ 琼 脂 凝 胶 免 疫 扩 散 试 验 （ｇｒｇｌ ． ａａ ｅ
细 胞 系 中增 殖 ， Ｂ Ｋ．１ ｅｏＥ 如 Ｈ ２ 、Ｖ ｒ．６细 胞 等 ［。 碧 ５周 】
君 等 ［研 究 表 明 ， 织 病 料 对 Ｖ ｒ—６细 胞 的适 应 ６ 组 ｅｏＥ
性 比对 Ｂ － １ 胞 要 好 ， 者可 用 于 临床 组 织 样 本 ＨＫ ２ 细 前
中羊 痘病 毒 的初 次分 离 。 病毒 接种 后 ２ ４ｈ出现 细胞 病
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中 动 检 ０ 年 ８ 第１期 国 物 疫２ １ 第２卷 ０ １
山羊痘病毒 属病 毒检 测技 术研 究进展
肖 雯 。聂福 平 王 ， ～， 昱 肖进 文 李 应 国 。 ３刘 力 ～， ～， ，
（． １西南大学动物科技 学院， 重庆北碚 ４０ １ ； ０７５ ２ 重庆 出入境检验检 疫局， ． 重庆江北 ４ ０２ ；３ 重庆进 出口食品安全工程技术研究 中心， ００ ０ ． 重庆江北 ４ ０２ ） ０ ００
长 ， 代 或 次 代 羔 羊 睾 丸 （Ｔ 细 胞 和 羔 羊 肾（ Ｋ） 原 Ｌ） Ｌ 细
国 际 贸 易 ［］山羊 痘 最 早 于 公 元 前 ２０年 在 欧 洲 发 １ｏ － ２ ０ 现 ， 羊痘 最 早 于 １ 纪在 英 国发现 ， 绵 ３世 山羊 痘 和绵 羊 痘 统 称 羊 痘 ， 动 物 痘 病 中最 为 严 重 的 一 种 ， 病 率 是 发
２ ５ 间 接 血 凝 试 验（ｎ ｉ ｃ ｈ ｍａ ｇｕｉａｉｎａｓｙ ． ｉｄ ｅｔ ｅ ｇ ｌ ｎ ｔ ｓａ ， ｒ ｔ ｏ
Ｉ ＨＡ）
３ 分子 生物 学检 测 技术 随 着 聚 合 酶 链 式 反 应 （ ｏｙ ｒｓ ｈｉ Ｐ ｌｍｅａｅＣ ａ ｎ Ｒ ａｔ ｎ Ｃ 方法 的 日益 成 熟 ， ｅｃｉ ，Ｐ Ｒ） ｏ 该技 术 已广泛 用 于 病 毒 的分 类 、 定 和疾 病 诊 断 。Ｃ Ｐ 鉴 ａ Ｖ属 于 双股 ＤＮＡ 病 毒， 适 于 Ｐ Ｒ检测 ｎ 之。 更 Ｃ 已报 到 的 羊 痘 病 毒 Ｐ Ｒ检 测 方 法 中， 物 多根 据 编码 羊 痘 衣 壳 蛋 白 Ｐ ２ Ｃ 引 ３ 和 反 向末 端 重 复 序 列 （ｎ ｅｔｄｔｒ ｎｌｅｅｔ Ｔ Ｉｖｒ ｍｉａ ｒｐａ，ＩＲ） ｅ ｅ 设 计 。 外 Ｉ ｌ ｄ［ 国 ｒ ａ ２ Ｈｅ ｅ等 【 根 据 Ｐ ２基 因序 ｅ ｎ 和 ｉ ｎ ３ 列 设计 了相应 的 引物 ， 建立 了检测 皮 肤样 品 中羊痘 病 毒 的 Ｐ Ｒ方 法 ， 利 用 限 制 性 内切 酶做 了进 一 步 的 Ｃ 并
中图分类号：￥ ５ ． ４ ８ ２６ ５ 文 献标 识码 ：Ａ 文章编号 ：１０ ．４ Ｘ （ ０ １ ００ ６ ．４ ０ ５９４ ２ １ ）１ ．０ ６０
山 羊 痘 病 毒 属 （ ａｒ ｏ ｖ ｕ ，Ｃ Ｐ 包 括 山 羊 Ｃ ｐ ｉ ｘ ｉ ｓ ａ Ｖ） ｐ ｒ 痘病 毒 （ ｏ ｔｏ ｉ ｓ Ｇ ａ ｘ ｖ ｕ ，ＧＰ 、 羊 痘病 毒 （ｈ ｅｐ ｘ ｐ ｒ Ｖ）绵 Ｓ ｅｐ ｏ ｖ ｕ ，Ｓ Ｖ） 牛 结 节 疹 病 毒 （ ｕ ｙ ｓｉ ｉｅｓ ｉｓ Ｐ 和 ｒ Ｌ ｍｐ ｎｄｓａｅ ｋ
巴结 内存 在 大 量病 毒粒 子 ， 作 为病 原分 离培 养 的病 可
料 标 本 ， 片 负 染 后 ， 接 在 透 射 电镜 下 观 察 病 毒 粒 切 直
子进行诊 断。 由于 羊 痘 属三 种 病 毒 形 态相 似 ， 与 正 且
ｖ ｕ ，Ｌ ＤＶ）属 于 痘 病 毒 科 （ｏ ｖ ｄｅ 脊 椎 动 物 ｉｓ Ｓ ｒ ， Ｐｘｉ ａ） ｄ
山羊痘病 例 的诊 断 】 。
Ｐ ２蛋 白抗 原 在 Ｅ ＩＡ 中反 应 性 好 ， 敏 度 、 ３ ＬＳ 灵 特 异 性 较 ＡＧＩ 高 ， 进 行批 量 样 品 的检 测 ， 国 际通 Ｄ 可 与 用 的 ＮＴ比较 ， 与其 他痘 病毒 也无 交叉 反应 、 需要 有 不 组 织 培养 条 件 、 测样 本 量 大 、 于推 广 等优 点 ［－１ 检 便 １１， １ ４ 但 是 ， 跨膜 区对 细胞 有 毒 性 ， 其 表 达量 较低 ， 其 使 重组 Ｐ ２蛋 白很难 纯 化 ［ ， ３ １ 而截 取 跨膜 区会对 Ｐ ２蛋 白免 ３ 疫 原性 有 一定 影 响 ［ 因而推 广受 到 限制 。 １ ， 目前 ，Ｐ ２ ３
一
并与 周 围细 胞 分 离 ， 圆化 ， 色 质贴 近 细 胞膜 。 毒 分 染 病
识和 技 能 ， 因而在 应用 上 受到 限制 。
离培 养 特 异性 较 高 ， 耗 时 、 但 费力 ， 要较 高 的专 业 知 需 ２ 血清 学检 测技 术
２ １ 中和 试 验（ ｅｔ ｌ ａｉｎｔｓ，ＮＴ） ． ｎ ｕｒ ｉ ｔ ｔ ａｚ ｏ ｅ
痘 病 毒 亚 科 （ｈ ｒｏｏ ｖ ｄｅ ， 别 引 起 山 羊 痘 、 Ｃ ｏｄｐ ｘ ｉ ａ ） 分 ｒ 绵羊痘 和牛结节 疹， 染动物表 现为发 热， 肤、 感 皮 黏 膜 、 官 表 面 广 泛 性 丘 疹 或 结 节 ， 肤 水 肿 ， 巴 结 器 皮 淋 肿 大 ， 瘦 ， 乳 量 大 幅 度 降低 ， 重 时 导致 死 亡 ， 消 产 严 给 养 殖 业 带 来 较 大 的 危 害 ， 成 严 重 的 经 济 损 失 ， 碍 造 阻
蛋 白的体 外表 达 已成为 国际上 羊痘研 究 的热 点 ［之 。 １
２４ 对 流 免疫 电泳（ｏｎｅ ． ｃｕ ｔ ｉ ｒｍｍｕｅｅ ｃ ｏｈ ｒｓ ， ｎ ｌ ｔ ｐ ｏｅｉ ｅｒ ｓ
ＣＩ Ｅ）
Ｃ Ｅ是一 种 常用 的检 测抗 原或 抗 体 的方法 ，１ ８ Ｉ ９８
年 首次 用 于检 测 羊 痘病 毒 抗 体 ， 果显 示 用 灭活 的抗 结 原 与抗 体 具 有 同等 的敏感 性 ， ＡＧＰ相 比， 检 出率 与 其 更 高 。１９ 年 ，Ｊｓｉ 用 生理 盐 水 溶 液 替代 巴 比妥 ９９ ｏｈ 等 缓 冲 液 ， 进 的后 Ｃ Ｅ与 常 规 Ｃ Ｅ相 比 ， 提 高检 测 改 Ｉ Ｉ 可 的灵 敏度 。 碧 君等 ［研 究发 现 ＣＥ能提 高 对抗 原或 周 ９ 】 Ｉ 抗 体 的分 辨 能 力 ， Ａ Ｄ敏 感 且 速 度 快 。 方 法 比 较 ＧＩ 该 较简 单经 济 ， 需要 一定 的设 备 。 但
痘 病 毒 也很 难 区别 ， 需要 尽 可 能多观 察 以确 定病 毒 形
业 设 备 ， 以满 足快 速 诊 断的 需要 。 难
１ ２ 病毒 培养 ．
态。 该方 法检 出率 低 ， 时长 ， 病 区往 往 无这 样 的专 耗 发
ＣＰ ａ Ｖ可 在 山 羊 、 羊 、 的 组 织 培 养 细 胞 上 生 绵 牛
抗 原 的 定 量 测 定 。Ｉ Ａ 用 于 实 验 室 检 测 Ｃ Ｐ 比 Ｈ ａＶ
确 诊 。Ｍａｋｕ ｔ 等 口 ｒｏ ｌｏ ａｓ 针 对 Ｓ Ｖ 的 ＩＲ和 Ｑ 微 Ｐ Ｔ
管 蛋 白基 因 设计 ３对 引物 ， 建立 了用 于检 测 皮肤 组 织 中 Ｓ Ｖ 的多 重 Ｐ Ｒ技 术 ， 方 法 敏 感 性 和 特 异 性 较 Ｐ Ｃ 该 好 ， 偶 尔 会 出现 假 阴性 结 果 。Ｈ ｓｍａｉ 【 据 但 ｏａ ｎ 等 ２ 依
般 为 １ ２ 但 在 某 些 情 况 下 可 达 ２％～ ５ 近 ％～ ％， ０ ８％，
机 体 感染 Ｃ Ｐ 后 主要 产 生 细 胞 免疫 应 答 ， 产 ａＶ 仅
年来， 随着 国 际 贸 易 的 日益 频 繁 ， 病 在 非洲 以外 地 该 区扩 散 的趋 势 。 界 动 物 卫 生 组 织 （ Ｅ） 山 羊 痘 、 世 ＯＩ 将 绵 羊 痘和 牛 结节 疹 列 为法 定通 报 传 染 病 ， 国将 山羊 我
摘
要： 山羊痘病毒属 包括 山羊痘 病毒 、 绵羊痘 病毒 和牛结节疹病毒 ， 分别 引起 山羊痘 、 绵羊痘和牛 结节疹 ， 染动物发 热、 感 局
部 或全身 出现丘疹 或结节 ， 坏皮 张， 乳量下降 ， 成严 重经济损 失并具有 重要 的公共 卫生意义 。 就近年来 国 内外对该类 病 损 产 造 文章 毒在 病原 学、 清学、 血 分子生物 学等方 面的检 测技 术与方法进行综述， 以促进对羊 痘病毒检 测技 术的进一 步研 究和发展 。 关键 词：羊痘病毒； 测； 究进展 检 研
５ ％～ ０ 病 死 率 ２ ％～ ０ 其 中 羔 羊 致 死 率 可 达 ０ ８ ％， ０ ８ ％， １０ 世 界 各 国均 有 羊 痘 发病 和 流 行 的相 关 报 道 ， ０ ％。 目 前非洲北部、 中东 和 亚 洲 的部 分 国家 流 行 较 为 严 重 。
胞 最 为敏 感 ， 其 是 毛 用 绵 羊细 胞 ， 可 在 某 些 传 代 尤 也