柠檬酸循环
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(for a new carbonyl group: 3rd → 2nd alcohol)
less than 10% at pH 7.4 & 25 ℃
Pro-C*
因异柠檬酸被快速消耗而 使该反应能正向进行
15
16-10
自学
iron-sulfur center in aconitase
Role = both in binding of substrate at active site & in catalytic addition or removal of H2O
P30-15
反应④ -酮戊二酸氧化脱羧成琥珀酰-CoA
- -酮戊二酸脱氢酶 (KDH, ~ PDH in Fig. 11-1) - 2nd次脱氢(→NADH) - 2nd次(氧化)脱羧 - -酮戊二酸氧化的能量部分被储存于琥珀酰-CoA的硫酯键中
(KDH)
18
P30-16
反应⑤ 琥珀酰-CoA转化成琥珀酸
- 脊椎类肝、肾的主要 回补反应为丙酮酸羧 化(乙酰-CoA可别构 激活该酶→TCA加速)
Anaplerotic Reactions
(cf. Fig. 11-10)
29
16-16
复习
- 1st阶段(①~③) 碳酸氢盐在活性 位点1被活化为 CO2并用于使生 物素羧化
- 2nd阶段(⑤~⑦) CO2在活性位点2 被重新释出并与 丙酮酸缩合成草 酰乙酸
柠 檬 酸 循 环
27
20-5 (3rd)
无论其来源如何， 乙酰-CoA都不能 在动物体内用作为 糖异生的前体
通过TCA循环后 总会有2C以CO2 的形式脱下，不能 净产生草酰乙酸
28
16-15
回补反应可以补充
柠檬酸循环中间物
(cf. p317~)
- 各中间物被合成途径 抽调用作前体的速率 一般与回补速率处于 动态平衡
复习
(cf. p304 & Fig. 10-10)
B:
质子化形成的羟 乙基TPP经由碱 催化而断裂释出 乙醛，随即经酸 催化返回TPP
脱羧化形成的负 离子可经由噻唑 环共振稳定
10
LW-2
小结：乙酰-CoA生成
- 在丙酮酸脱氢酶复合体的催化下，糖酵解产生的丙酮酸 被转化成乙酰-CoA，是为柠檬酸循环的起始底物 - PDH复合体由三种酶的多份拷贝组成：丙酮酸脱氢酶E1 (+TPP)，二氢硫辛酰转乙酰基酶E2 (+硫辛酸和CoA)， 以及二氢硫辛酰脱氢酶E3 (+FAD和NAD+) - E1先催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP，然后将羟乙基 氧化成乙酰基，移除的e–将结合在E2上的硫辛酰-S-S还原，并将乙酰基在两个-SH之一上酯化成硫酯 - E2催化乙酰基转酯给CoA而生成乙酰-CoA - E3催化硫辛酰氧化态二硫桥的再生，e–则依次传递给 FAD和NAD+
- 苹果酸脱氢酶 - 虽然平衡大大有利于逆行，但由于草酰乙酸持续被高度放能的 柠檬酸合酶反应所移除，该反应在完整细胞中仍为正向进行
- 4th次脱氢(→NADH)
[OAA] < 10–6M
24
16-13
柠檬酸循环结算
总反应：Acetyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O
11
P30-11
§ 2. 柠檬酸循环
在该酶系反应中…
~ 底物(被消耗) ~ 辅助因子(可再生)
6C 2C
= 八步酶促反应
- 四步氧化反应将能量高效 储存在NADH和FADH2中 ①缩合 ②异构(脱水-水合) ③氧化脱羧
4C
⑧脱氢
5C
⑦水合 ⑥～⑧再生 草酰乙酸 ⑥脱氢
4C
④氧化脱羧
⑤底物水平磷酸化
- 各酶拷贝数及复合体 大小随物种不同而异 E. coli: 24 E1 24 E2 12 E3
60 E2 = 20 trimers
8
16-6
PDH作用机制
substrate channeling ③乙酰基转酯生成 乙酰-CoA和完全 还原态硫辛酰基
②羟乙基氧化为乙酰基，由半还原态 硫辛酰基携带，为活化态乙酰基硫酯 (~氧化能驱动高能乙酰硫酯的形成)
丙酮酸脱氢酶复合体 (PDH = 3 enzymes + 5 cofactors)
E1: 丙酮酸脱氢酶 E2: 二氢硫辛酰转乙酰基酶 E3: 二氢硫辛酰脱氢酶 硫胺素焦磷酸(TPP) 硫辛酸, 辅酶A (CoA) FAD, NAD+
硫辛酸与 E2-Lys 共价结合
- 硫辛酰基的氧化态-还原态 互变可用作H或酰基载体 - 砷酸盐有毒：与之共价结合 而阻断还原态-氧化态互变
磷 酸 泛 酰 巯 基 乙 胺
泛酸 (B3)
(pantos = everywhere)
CoA酰化形成的硫酯键为 高能键，在亲核攻击下要 比氧酯更容易将酰基转移
3’-P-ADP酯 * Deficiencies are only for severe malnutrition
7
16-5
自学
PDH结构 (牛肾细胞)
柠檬酸循环的调节
乙醛酸循环
1
16-1
细胞呼吸的三个主要阶段 乙酰-CoA生成 - 胞液/线粒体
乙酰-CoA氧化(~柠檬酸循环) - 线粒体基质(真核类) - 胞液(原核类)
电子传递 & 氧化磷酸化 - 线粒体内膜(真核类) - 质膜(原核类)
2
qh9-3a
真核生物的柠檬酸循环 酶系分布在线粒体基质
丙酮酸羧化酶作用机制
(辅基生物素=1C载体)
Avidin可与之结 合而阻断其吸收
30
LW-3
小结：柠檬酸循环
- 该循环是一种几乎存在于所有物种的中心异化途径， 其酶系在真核和原核类分别位于线粒体和胞液中； 糖、脂及蛋白降解而得的各种化合物都能通过该途径 最终氧化成CO2 - 循环由八步连续反应组成：从乙酰-CoA与草酰乙酸 缩合成柠檬酸开始，逐步将其转化回草酰乙酸，期间 经由两步氧化脱羧释出 2CO2；乙酰基氧化释放出的 能量分别储存于 3 NADH、1 FADH2和 1 GTP/ATP - 该循环为异化/同化两用途径：任何可以转化成循环中 4C/5C中间物的化合物都能经由该循环被氧化，而各 中间物亦可用作多种生物合成的反应前体；由丙酮酸 羧化酶等催化的填补反应可以补充被调用的中间物
5
G18.17/18
复习
硫胺素焦磷酸是维生素B1衍生物
(cf. Fig. 10-9) 嘧啶环
噻唑环 易失去而形成高反 应活性的负碳离子
-裂解
乙醛
-缩合
丙酮酸
乙酰乳酸
6
G18.23
复习
巯基乙胺 (酰化/去酰化部位)
CoA是泛酸衍生物
(cf. Fig. 11-4)
通常用作酰基载体参与反应 (活化酰基)
- 琥珀酰-CoA合成酶 (琥珀酸硫激酶) 尽管其-磷酰基很容 易转移给ADP以形成 ATP，但其主要功能 还是用作蛋白质合成 中的磷酰基供体
- 硫酯键的断裂被用于驱动GTP (animal) 或ATP中磷酸酐键的形成
= 以NTP形式保存能量的底物水平磷酸化
19
16-12
自学
琥珀酰-CoA合成酶 反应机制
复习
- 负碳离子机制
attacked by H2O or OH– to give a carbanion, followed by protonation
1ຫໍສະໝຸດ BaiduO
exchange experiment proved this is the true story
23
P30-18
反应⑧ L-苹果酸氧化成草酰乙酸
(cf. Fig. 11-8)
~ 磷酸解 ① A phosphoryl group replaces CoA in succinyl-CoA bound to enzyme, forming a high-energy acyl phosphate ② Succinyl phosphate donates its phosphoryl group to enzyme’s His246, forming a high-energy phosphohistidyl enzyme ③ The phosphoryl group is transferred from His246 to GDP/ADP, forming GTP/ATP. 琥珀酰-P-E
*
prochiral C but aconitase can identify its two different carboxymetheyl groups helpful for putting citrate in active site
(cf. p311 for KDH’s reaction & Fig. 11-7)
Essentially a Claisen condensation, involving a thioester (acetyl-CoA) & a ketone (oxaloacetate)
(cf. Fig. 11-6)
CoA
H2O
14
P30-13
反应② 柠檬酸经由顺-乌头酸异构化成异柠檬酸
- 乌头酸酶 (乌头酸水合酶) - 反应 = 脱水+水合 - 净效应 = –H与–OH互换
反应⑦ 延胡索酸水合生成L-苹果酸
- 延胡索酸(水合)酶 - 反式双键水合 = 反式添加OH–和H+ 负碳离子 转化态 马来酸 (顺丁烯二酸)
该酶具有高度立体特异性
22
G20.18
Two possible mechanisms for the fumarase reaction
- 正碳离子机制 protonation of double bond to form an intermediate carbonium ion
酵解产生的丙酮酸首先要 被转运进线粒体内，然后 才能被其脱氢酶系氧化脱 羧而转换成乙酰-CoA (but not for those produced by FA or AA)
3
16-2
§ 1. 乙酰-CoA的生成
总反应 = 丙酮酸在线粒体内的 不可逆氧化脱羧
丙酮酸脱氢酶复合体 (PDH)
4
16-4
LW-1
柠檬酸循环
Citric Acid Cycle (TCA)
线粒体基质中发生的、将乙酰-CoA的 2C最终氧化生成CO2的一系列反应
- 有氧代谢的枢纽 - 分解、合成两用途径 乙酰-CoA的生成 柠檬酸循环反应
NP in Phys/Med 1953 "for his discovery of the citric acid cycle"
12
P30-12
反应① 乙酰-CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸
- 柠檬酸合酶 - 乙酰基甲基C与草酰 乙酸C2羰基缩合
- 生成酶结合中间物 柠檬酰-CoA
反应机制 (cf. p309)
Pro-C*
其高能硫酯键水解使反应不可逆
13
16-9
自学
The mechanism for citrate synthase reaction
16
P30-14
反应③ 异柠檬酸氧化脱羧成-酮戊二酸
- 异柠檬酸脱氢酶
NADP依赖性酶 主要分布于胞液
- 1st次脱氢(→NADH)
- 1st次(氧化)脱羧
反应机制 (cf. p311, as for 6-P-葡糖酸-D)
脱羧
氧化
重排
草酰琥珀酸为不稳定酮酸，容易脱羧
有助于稳定脱羧后短 17 暂形成的烯醇中间物
磷酰-His-E
20
P30-17a
反应⑥ 琥珀酸氧化成延胡索酸
- 琥珀酸脱氢酶 - 该循环中惟一(共价)结合在线粒体 内膜或质膜上的酶，具有3个Fe-S 中心簇和1个共价结合的FAD - 3rd次脱氢(→FADH2) 强 烈 抑 制
丙二酸
(with stronger oxidant FAD)
21
p612b
①丙酮酸脱羧生成 羟乙基-TPP (限速)
(cf. Fig. 11-1)
④-⑤为下一轮反应再生出氧化态硫 辛酰基，并将底物的2e–传递给NAD+
9
TPP’s role in pyruvate decarboxylation
去质子化成 TPP负碳离子 TPP负碳离子对 丙酮酸的羰基C 发动亲核攻击 (羰基加成)
2 CO2 + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP + CoA
25
t16-1
葡萄糖有氧氧化全程中的辅酶还原及ATP生成总结算
(cf. Tab. 11-2)
26
H12.5
自学
每轮循环中释出的并非该轮反应 开始时以乙酰基形式进入的2C
(cf. p315)
The plane of symmetry of succinate means that the 2 halves of the molecule are chemically equivalent; thus, carbon atoms from acetyl CoA are uniformly distributed in the 4-C intermediates leading to oxaloacetate. Carbon atoms from acetyl CoA that enter in one turn of the cycle are thus lost as CO2 only in the 2nd and subsequent turns.
less than 10% at pH 7.4 & 25 ℃
Pro-C*
因异柠檬酸被快速消耗而 使该反应能正向进行
15
16-10
自学
iron-sulfur center in aconitase
Role = both in binding of substrate at active site & in catalytic addition or removal of H2O
P30-15
反应④ -酮戊二酸氧化脱羧成琥珀酰-CoA
- -酮戊二酸脱氢酶 (KDH, ~ PDH in Fig. 11-1) - 2nd次脱氢(→NADH) - 2nd次(氧化)脱羧 - -酮戊二酸氧化的能量部分被储存于琥珀酰-CoA的硫酯键中
(KDH)
18
P30-16
反应⑤ 琥珀酰-CoA转化成琥珀酸
- 脊椎类肝、肾的主要 回补反应为丙酮酸羧 化(乙酰-CoA可别构 激活该酶→TCA加速)
Anaplerotic Reactions
(cf. Fig. 11-10)
29
16-16
复习
- 1st阶段(①~③) 碳酸氢盐在活性 位点1被活化为 CO2并用于使生 物素羧化
- 2nd阶段(⑤~⑦) CO2在活性位点2 被重新释出并与 丙酮酸缩合成草 酰乙酸
柠 檬 酸 循 环
27
20-5 (3rd)
无论其来源如何， 乙酰-CoA都不能 在动物体内用作为 糖异生的前体
通过TCA循环后 总会有2C以CO2 的形式脱下，不能 净产生草酰乙酸
28
16-15
回补反应可以补充
柠檬酸循环中间物
(cf. p317~)
- 各中间物被合成途径 抽调用作前体的速率 一般与回补速率处于 动态平衡
复习
(cf. p304 & Fig. 10-10)
B:
质子化形成的羟 乙基TPP经由碱 催化而断裂释出 乙醛，随即经酸 催化返回TPP
脱羧化形成的负 离子可经由噻唑 环共振稳定
10
LW-2
小结：乙酰-CoA生成
- 在丙酮酸脱氢酶复合体的催化下，糖酵解产生的丙酮酸 被转化成乙酰-CoA，是为柠檬酸循环的起始底物 - PDH复合体由三种酶的多份拷贝组成：丙酮酸脱氢酶E1 (+TPP)，二氢硫辛酰转乙酰基酶E2 (+硫辛酸和CoA)， 以及二氢硫辛酰脱氢酶E3 (+FAD和NAD+) - E1先催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP，然后将羟乙基 氧化成乙酰基，移除的e–将结合在E2上的硫辛酰-S-S还原，并将乙酰基在两个-SH之一上酯化成硫酯 - E2催化乙酰基转酯给CoA而生成乙酰-CoA - E3催化硫辛酰氧化态二硫桥的再生，e–则依次传递给 FAD和NAD+
- 苹果酸脱氢酶 - 虽然平衡大大有利于逆行，但由于草酰乙酸持续被高度放能的 柠檬酸合酶反应所移除，该反应在完整细胞中仍为正向进行
- 4th次脱氢(→NADH)
[OAA] < 10–6M
24
16-13
柠檬酸循环结算
总反应：Acetyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O
11
P30-11
§ 2. 柠檬酸循环
在该酶系反应中…
~ 底物(被消耗) ~ 辅助因子(可再生)
6C 2C
= 八步酶促反应
- 四步氧化反应将能量高效 储存在NADH和FADH2中 ①缩合 ②异构(脱水-水合) ③氧化脱羧
4C
⑧脱氢
5C
⑦水合 ⑥～⑧再生 草酰乙酸 ⑥脱氢
4C
④氧化脱羧
⑤底物水平磷酸化
- 各酶拷贝数及复合体 大小随物种不同而异 E. coli: 24 E1 24 E2 12 E3
60 E2 = 20 trimers
8
16-6
PDH作用机制
substrate channeling ③乙酰基转酯生成 乙酰-CoA和完全 还原态硫辛酰基
②羟乙基氧化为乙酰基，由半还原态 硫辛酰基携带，为活化态乙酰基硫酯 (~氧化能驱动高能乙酰硫酯的形成)
丙酮酸脱氢酶复合体 (PDH = 3 enzymes + 5 cofactors)
E1: 丙酮酸脱氢酶 E2: 二氢硫辛酰转乙酰基酶 E3: 二氢硫辛酰脱氢酶 硫胺素焦磷酸(TPP) 硫辛酸, 辅酶A (CoA) FAD, NAD+
硫辛酸与 E2-Lys 共价结合
- 硫辛酰基的氧化态-还原态 互变可用作H或酰基载体 - 砷酸盐有毒：与之共价结合 而阻断还原态-氧化态互变
磷 酸 泛 酰 巯 基 乙 胺
泛酸 (B3)
(pantos = everywhere)
CoA酰化形成的硫酯键为 高能键，在亲核攻击下要 比氧酯更容易将酰基转移
3’-P-ADP酯 * Deficiencies are only for severe malnutrition
7
16-5
自学
PDH结构 (牛肾细胞)
柠檬酸循环的调节
乙醛酸循环
1
16-1
细胞呼吸的三个主要阶段 乙酰-CoA生成 - 胞液/线粒体
乙酰-CoA氧化(~柠檬酸循环) - 线粒体基质(真核类) - 胞液(原核类)
电子传递 & 氧化磷酸化 - 线粒体内膜(真核类) - 质膜(原核类)
2
qh9-3a
真核生物的柠檬酸循环 酶系分布在线粒体基质
丙酮酸羧化酶作用机制
(辅基生物素=1C载体)
Avidin可与之结 合而阻断其吸收
30
LW-3
小结：柠檬酸循环
- 该循环是一种几乎存在于所有物种的中心异化途径， 其酶系在真核和原核类分别位于线粒体和胞液中； 糖、脂及蛋白降解而得的各种化合物都能通过该途径 最终氧化成CO2 - 循环由八步连续反应组成：从乙酰-CoA与草酰乙酸 缩合成柠檬酸开始，逐步将其转化回草酰乙酸，期间 经由两步氧化脱羧释出 2CO2；乙酰基氧化释放出的 能量分别储存于 3 NADH、1 FADH2和 1 GTP/ATP - 该循环为异化/同化两用途径：任何可以转化成循环中 4C/5C中间物的化合物都能经由该循环被氧化，而各 中间物亦可用作多种生物合成的反应前体；由丙酮酸 羧化酶等催化的填补反应可以补充被调用的中间物
5
G18.17/18
复习
硫胺素焦磷酸是维生素B1衍生物
(cf. Fig. 10-9) 嘧啶环
噻唑环 易失去而形成高反 应活性的负碳离子
-裂解
乙醛
-缩合
丙酮酸
乙酰乳酸
6
G18.23
复习
巯基乙胺 (酰化/去酰化部位)
CoA是泛酸衍生物
(cf. Fig. 11-4)
通常用作酰基载体参与反应 (活化酰基)
- 琥珀酰-CoA合成酶 (琥珀酸硫激酶) 尽管其-磷酰基很容 易转移给ADP以形成 ATP，但其主要功能 还是用作蛋白质合成 中的磷酰基供体
- 硫酯键的断裂被用于驱动GTP (animal) 或ATP中磷酸酐键的形成
= 以NTP形式保存能量的底物水平磷酸化
19
16-12
自学
琥珀酰-CoA合成酶 反应机制
复习
- 负碳离子机制
attacked by H2O or OH– to give a carbanion, followed by protonation
1ຫໍສະໝຸດ BaiduO
exchange experiment proved this is the true story
23
P30-18
反应⑧ L-苹果酸氧化成草酰乙酸
(cf. Fig. 11-8)
~ 磷酸解 ① A phosphoryl group replaces CoA in succinyl-CoA bound to enzyme, forming a high-energy acyl phosphate ② Succinyl phosphate donates its phosphoryl group to enzyme’s His246, forming a high-energy phosphohistidyl enzyme ③ The phosphoryl group is transferred from His246 to GDP/ADP, forming GTP/ATP. 琥珀酰-P-E
*
prochiral C but aconitase can identify its two different carboxymetheyl groups helpful for putting citrate in active site
(cf. p311 for KDH’s reaction & Fig. 11-7)
Essentially a Claisen condensation, involving a thioester (acetyl-CoA) & a ketone (oxaloacetate)
(cf. Fig. 11-6)
CoA
H2O
14
P30-13
反应② 柠檬酸经由顺-乌头酸异构化成异柠檬酸
- 乌头酸酶 (乌头酸水合酶) - 反应 = 脱水+水合 - 净效应 = –H与–OH互换
反应⑦ 延胡索酸水合生成L-苹果酸
- 延胡索酸(水合)酶 - 反式双键水合 = 反式添加OH–和H+ 负碳离子 转化态 马来酸 (顺丁烯二酸)
该酶具有高度立体特异性
22
G20.18
Two possible mechanisms for the fumarase reaction
- 正碳离子机制 protonation of double bond to form an intermediate carbonium ion
酵解产生的丙酮酸首先要 被转运进线粒体内，然后 才能被其脱氢酶系氧化脱 羧而转换成乙酰-CoA (but not for those produced by FA or AA)
3
16-2
§ 1. 乙酰-CoA的生成
总反应 = 丙酮酸在线粒体内的 不可逆氧化脱羧
丙酮酸脱氢酶复合体 (PDH)
4
16-4
LW-1
柠檬酸循环
Citric Acid Cycle (TCA)
线粒体基质中发生的、将乙酰-CoA的 2C最终氧化生成CO2的一系列反应
- 有氧代谢的枢纽 - 分解、合成两用途径 乙酰-CoA的生成 柠檬酸循环反应
NP in Phys/Med 1953 "for his discovery of the citric acid cycle"
12
P30-12
反应① 乙酰-CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸
- 柠檬酸合酶 - 乙酰基甲基C与草酰 乙酸C2羰基缩合
- 生成酶结合中间物 柠檬酰-CoA
反应机制 (cf. p309)
Pro-C*
其高能硫酯键水解使反应不可逆
13
16-9
自学
The mechanism for citrate synthase reaction
16
P30-14
反应③ 异柠檬酸氧化脱羧成-酮戊二酸
- 异柠檬酸脱氢酶
NADP依赖性酶 主要分布于胞液
- 1st次脱氢(→NADH)
- 1st次(氧化)脱羧
反应机制 (cf. p311, as for 6-P-葡糖酸-D)
脱羧
氧化
重排
草酰琥珀酸为不稳定酮酸，容易脱羧
有助于稳定脱羧后短 17 暂形成的烯醇中间物
磷酰-His-E
20
P30-17a
反应⑥ 琥珀酸氧化成延胡索酸
- 琥珀酸脱氢酶 - 该循环中惟一(共价)结合在线粒体 内膜或质膜上的酶，具有3个Fe-S 中心簇和1个共价结合的FAD - 3rd次脱氢(→FADH2) 强 烈 抑 制
丙二酸
(with stronger oxidant FAD)
21
p612b
①丙酮酸脱羧生成 羟乙基-TPP (限速)
(cf. Fig. 11-1)
④-⑤为下一轮反应再生出氧化态硫 辛酰基，并将底物的2e–传递给NAD+
9
TPP’s role in pyruvate decarboxylation
去质子化成 TPP负碳离子 TPP负碳离子对 丙酮酸的羰基C 发动亲核攻击 (羰基加成)
2 CO2 + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP + CoA
25
t16-1
葡萄糖有氧氧化全程中的辅酶还原及ATP生成总结算
(cf. Tab. 11-2)
26
H12.5
自学
每轮循环中释出的并非该轮反应 开始时以乙酰基形式进入的2C
(cf. p315)
The plane of symmetry of succinate means that the 2 halves of the molecule are chemically equivalent; thus, carbon atoms from acetyl CoA are uniformly distributed in the 4-C intermediates leading to oxaloacetate. Carbon atoms from acetyl CoA that enter in one turn of the cycle are thus lost as CO2 only in the 2nd and subsequent turns.