下一代测序技术简介

Life Technology公司
IonTorrent半导体测序芯片技术图示。A. 该芯片结构设计的逐层显示图。上层为单个 的DNA聚合反应的微池，底部两层构成场效应晶体管离子传感器。每个微池有其相对 应的场效应晶体管探头，以鉴别每一个pH值的变化。B. 侧面图：微池中，DNA聚合酶 将两个重复的TTP核苷酸掺入测序片段中。反应过程中释放出的氢离子被下方的场效 应晶体管检测到。
Roche 454测序步骤 四、emRCR
PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于 后续的步骤。
乳液PCR（emRCR）
Roche 454测序步骤 五、反应板准备、上机测序
454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每 个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。
将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利 用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条 件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链 DNA，通过控制条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。
Roche 454测序原理 Roche 454焦磷酸测序原理
Roche 454测序步骤 一、样品处理
样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用 超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化， 选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。
各个测序平台的特点总结 ABI SOLiD
1. 无以伦比的通量 目前SOLiD 3系统单次运行能产生50 GB的人基因组序列数据，相当于基因组的
17倍覆盖度，这显然是其他任一台新一代测序系统都无法达到的 2. 准确性。
新的超精确检测模块（ECC模块）将提供高达99.99%的精确性；多达98%的可定 位碱基的质量值高于45；更多标签以提高灵敏度和动态范围；高准确性的原始读 序，支持无参考序列的数据分析。
Roche 454测序步骤 六、测序和分析
将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。
在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应 四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这 个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出 这一位置的碱基信息。
致错误累积；阅读高重 复和同种多聚序列时有
使用修饰过的碱基） 潜在困难；
太平洋生物科学公司
太平洋生物科学公司（PacBio’s）实时单分子测序方案示意图。A. 单个零点启动模式 波导纳米结构的侧面图， 每个纳米结构含一个DNA聚合酶分子，固定于底部的玻璃面 上。波导纳米结构和共焦成像系统确保只对底部进行荧光检测。 B. 显示了荧光标记的 核苷酸底物掺入测序模板的过程。相应的瞬时荧光探测分为5个步骤。
本高（仪器昂贵）；
在第三代中通量最高；
在所有测序技术中，用 低读长； 模板制备妨
10
于拼接一个人基因组的 碍长重复序列区域测序； 试剂成本最低；每个测 样品制备费事；尚无商
序步骤独立，使错误的 业化供应的仪器
累积变得最低
对核酸碱基的掺入可直 一步步的洗脱过程可导
100-200
接测定；在自然条件下 进行DNA合成（不需要
Complete Genomics公司
Complete Genomics公司的DNB阵列生产和cPAL技术的方案示意图。A.待测片段的设计， DNA纳米球的合成，用来放置纳米球规则排列的纳米阵列---这些可以显示DNA纳米球 阵列的形成过程； B. 图示：用对应于一个独特接头位点的5个碱基的一组普通探针进 行测序过程。图中也显示了标准锚定序列和延伸锚定序列。
各个测序平台的特点总结
Roche 454
454平台的突出优势是读长。目前454系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平 台的测序成本比其他平台要高很多，不过对于那些需要长读长的应用，如从头拼 接和环境微生物组学，它仍是最理想的选择。
Illumina
1. 可扩展的超高通量 Genome Analyzer系统目前每次运行后可获得超过20 GB的高品质过滤数据。经优 化后通量还有望上升到95 GB，相当于人类基因组的30倍覆盖度。
第三代测序平台的比较差异
公司
平台名 称
测序方法
太平洋 生物科 学公司
（PacBio）
PacBio RS
实时单分 子DNA测
序
GeXP遗 复合探针
Complete Genomics
传分析
锚杂交和
系统 连接技术
Ion 个人基
Torrent/ 因组测
Life
序仪
合成测序 法
Technology （PGM）
统
连接测序 法
检测方 法
光学
荧光/光 学
荧光/光 学
大约读
长(碱基
优点
相对局限性
数)
样品制备较难；难于处
230-400
在第二代中最高读长； 比第一代的测序通量大
理重复和同种碱基多聚 区域；试剂冲洗带来错
误累积；仪器昂贵
2x150 很高测序通量
仪器昂贵；用于数据删 节和分析的费用很高
25-35
很高测序通量；在广为 测序运行时间长；读长 接受的几种第二代平台 短，造成成本高，数据 中，所要拼接出人类基 分析困难和基因组拼接 因组的试剂成本最低 困难；仪器昂贵
SOLID的双碱基编码矩阵
ABI SOLiD连接测序原理
探针的5′末端标记了1种颜色的荧光染料。探针3′端1～5位为随机碱基，其中第 1、2位构成的碱基对表征探针染料类型，而3～5位的“n”为随机碱基，6～8位 的“z” 是可以和任何碱基配对的特殊碱基。SOLiD测序反应的每一轮测序反应会 连接第1~5位的碱基，同时切除第6~8位的碱基，同时记录下第1~2位碱基决定 的荧光颜色。
Illumina测序原理 Illumina合成测序原理
Illumina测序流程
桥式PCR
合成法测序
数据读取
ABI SOLiD测序原理 ABI SOLiD连接测序原理
ABI SOLiD测序流程
制备DNA文库
乳液PCR/微珠富集
连接酶测序:SOLiD连接反应 的底物是8碱基单链荧光探 针混合物。连接反应中， 这些探针按照碱基互补规 则与单链DNA模板链配对。 这样经过五轮测序反应后 便可以得到所有的碱基序 列
第一代测序：Sanger Sequencing （Sanger测序） 第二代测序： NGS = Massively Parallel Sequencing （大规模平行测序）
第三代测序： NGS = HTS, SingleMolecule Sequencing （高通量、单分子测序）
目前NGS的主要三种测序仪器
Roche 454测序步骤 二、文库制备
文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由 20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’ 端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。
Roche 454测序步骤 三、连接微珠
三种测序仪在高 通量水平、测序 准确度、存储格 式和技术方法上 均有差异。
三大测序平台的技术特点和差异
公司
平台名 称
测序方法
罗氏 /454
基因组 测序仪 FLX系统
ห้องสมุดไป่ตู้
焦磷酸测 序法
HiSeq20 可逆链终 illumina 00/miSe 止物和合
q 成测序法
ABI/SOL iD
5500xlS OLiD系
Next Generation
Sequencing(NGS) 技术简介
Sanger 测序
Sanger 测序法仍然为基因测序行业内的金标准，但鸟枪测序法在技术上存在 瓶颈。（价格昂贵、步骤繁琐、效率低）
NGS = Next Generation Sequencing NGS也称为高通量测序High-throughput Sequencing (HTS)
检测方 法
荧光/光 学
荧光/光 学
以离子 敏感场 效应晶 体管检 测pH值
变化
大约读
长(碱基
优点
相对局限性
数)
并不能高效地将DNA聚
~1000
高平均读长，比第一代 的测序时间降低；不需 要扩增；最长单个读长 接近3000碱基
合酶加到测序阵列中； 准确性一次性达标的机 会低（81-83%）；DNA 聚合酶在阵列中降解； 总体上每个碱基测序成
2. 需要样品量少 Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在很多样品有限的实验 （比如免疫沉淀、显微切割等）中。
3. 简单、快速、自动化 Genome Analyzer系统提供了最简单和简洁的工作流程。制备样品文库可以在几 小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。自动化的流程不减少了手工 操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。
ABI SOLiD连接测序原理
ABI SOLiD连接测序原理
两个碱基共同决定一 个颜色，可以极大的 提高测序的准确率。
ABI SOLiD连接测序原理
五轮测序反应反应后，按照第0、1位，第1、2位... …的顺序把对应于模板序列 的颜色信息连起来，就得到由“0，1，2，3…”组成的SOLiD原始颜色序列。