分子生物学研究方法

大肠杆菌β 半乳糖酶基因 (lacZ)的启动 子及其编码 α -肽链的DNA 序列
EcoRI SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
pUC19
LacZ
Apr
氨苄青霉 素抗性基 因(ampr)，
(2.68kb)
Ori
来自pBR322 质粒的复制 起点（ori）
B. 类型 • 插入型 （Insertion vectors ） 这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 如：λ gt10 、 λ gt11 克隆能力小，不到10kb • 置换型 （Replacement vectors） 这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的 λ DNA区段是λ 噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的 DNA取代。 如Charon 4 载体 克隆能力大，20～25kb
• 温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周 期。 • 复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制 溶菌周期的早期是“θ ”复制，晚期进行滚环复制 • 基因组成 DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列， 其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3 为非必须区段。
2
来源于pSC101 质粒的四环素 抗性基因 （tertr）
3
来源于ColE1的派生质粒 pMB1的DNA复制起点（ori）
（2）pUC质粒载体 位于lacZ基 因中的靠近 5’-端的一 段多克隆位 点(MCS)区 段，它并不 破坏该基因 的功能。
pUC18
HindIII SphI PstI SalI XbaI BamHI SmaI KpnI SacI EcoRI
ori
（二）类型
1、质粒载体 常用的克隆载体、双链环状的DNA分子（也有线 性的）、能独立地自我复制及转录。
作为克隆载体的质粒应具备以下特点:
①分子量小，稳定存在，较高拷贝数； ②遗传标志；
③内切酶点。
（1）pBR322质粒载体
来源于pSF2124质 粒转座子Tn3的氨 苄青霉素抗性基 因（ampr） 1
DNA重组的一般步骤
1. 从生物有机体基因 组中，分离出带有目 的基因的DNA片段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移 到适当的受体细胞（亦 称寄主细胞）并与之一 起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群 体中，筛选出获得了重 组DNA分子的受体细胞， 并筛选出已经得到扩增 的目的基因。
3、柯斯质粒载体
柯斯质粒(cosmid)又称 粘粒，是由λ DNA的cos 区与质粒重新构建的载 体，具有质粒相同的结 构特点，为双链、环状 DNA。“cosmid”一词是 由英文“cos sitecarrying plasmid”缩 写而成的，其原意是指 带有粘性末端位点的质 粒。因此我们说，所谓 柯斯质粒其实是一类由 人工构建的含有λ DNA的 cos序列和质粒复制子的 特殊类型的质粒载体。
（3）pGEM-3Z质粒
2、噬菌体 （1）噬菌体的生物学特性 溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然 后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装， 最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。(烈性 噬菌体只具有溶菌生长周期)
溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主 细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。 (温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期)
（一）特点
1. 至少有一个复制起点，因而 至少可在一种生物体中自主 复制。 PstI 2. 至少应有一个克隆位点，以 ScaI 供外源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因， 以指示载体或重组DNA分 子是否进入宿主细胞 4. 安全性
HindIII BamHI
SalI Amp
r
pBR322
(4.36 kb)
末端转移酶
DNA外切酶III λ 噬菌体DNA外切酶 碱性磷酸酯酶
在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸
从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸 从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
一、载体
基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子 进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。
进入细胞内部的M13（＋）链DNA，便 起到一种模板的作用，合成出互补的 （一）链 DNA。由此形成的双链形式 的M13DNA，称为复制型 DNA。它按θ 形式进行几轮复制之后，基因 Ⅱ的 产物便在RFDNA的正链待定位点上作 切割反应，形成一个缺口。这样， M13基因组的扩增活动便正式开始启 动。其基本特点是利用大肠杆菌的 DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA 为模板合成 M13（＋）DNA。当DNA复 制叉沿着模板DNA分子转移到复制终 点时，在基因Ⅱ编码产物的作用下， 新合成的（十）DNA便会被切除下去， 并进一步环化形成单位长度的 M13基 因组DNA
重组DNA实验中常见的主要工具酶
酶 类 功 能
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
识别并在特定位点切开DNA
通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连 接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA 双链中的缺口 反转录酶 多核苷酸激酶 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互 补原则合成DNA链 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末 端（进行末端标记实验或用来进行DNA的 连接
（3）M13噬茵体 A. 生物学特性 • 单链闭合环状噬菌体 只能感染雄性细菌，外形 成丝状，基因组DNA长 约6.4kb，可分为10个 区和507 bp基因间隔区 （IS区），该区可以接 受外源DNA的插入而不 会影响到噬菌体的活力。 这是该噬菌体能用于单 链DNA载体的重要前提。
• 复制与增殖
（Baidu Nhomakorabea）λ 噬菌体 A. 生物学特性
• 组成：蛋白质外壳和线 状双链DNA分子组成。 DNA长度为48502bp，在 分子两端各有12个碱基的 单链互补粘性末端。当其 注入到寄主细胞中后，可 以迅速通过这两个粘性末 端的互补作用形成双链的 环形DNA分子。上述通过 粘性末端互补形成的双链 区被称为cos位点 （cohesive end site）。